一种人凝血因子Ⅷ的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、离心分离、灭活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次离心分离、沉淀溶解、冻干及第二次病毒灭活等步骤。本发明专利技术所用全部试剂均为常规试剂，价格便宜，用肝素钠作为溶解液，提高了活性的回收率，且不使用氢氧化铝作为沉淀剂，避免了最终产品中残留铝。本发明专利技术操作简便、整个过程时间短、适合大规模工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制品领域，具体涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备方法。
技术介绍
甲型血友病又称为抗血友病球蛋白缺乏症或第Ⅷ因子缺乏症，是一种由于基因缺陷引起的凝血功能障碍性遗传病。患者多为男性，病人因体内缺乏凝血因子Ⅷ而经常发生内出血，仅靠自身机能难以止血。凝血因子Ⅷ是一种血浆高分子糖蛋白，由2332个氨基酸残基组成，在内源性凝血体系中起了十分重要的作用，是激活凝血因子IX的辅助因子。凝血因子Ⅷ替代疗法是治疗甲型血友病及预防急性出血发作最有效的措施，常用的替代品包括血浆、浓缩凝血因子Ⅷ及重组凝血因子Ⅷ等。按我国现有甲型血友病患者5-10万计算，每年维持国内患者治疗至少需要人凝血因子Ⅷ制品约80万瓶（200IU/瓶），每年缺口约40万瓶（200IU/瓶）。尽管目前市场上有进口基因重组凝血因子Ⅷ产品，但其价格是国内血浆类产品的4倍。国内大多数厂家在制备人凝血因子Ⅷ的过程中，使用柱层析，成本高。此外，使用氢氧化铝进行沉淀，容易导致最终产品中残留铝。因此，本领域需要开发出一种低成本、高收率的人凝血因子Ⅷ制备方法，简单可行，且能规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人凝血因子Ⅷ的制备方法。本专利技术的第一方面，提供一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，所述方法包括以下步骤：(a)将冷沉淀用40-80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6.1-6.5，溶液温度维持在20-35℃；>(b)将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为2.5%-4.5%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20-30℃；(c)对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液；(d)将磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得到混合溶液，并对所述混合溶液进行灭活；(e)将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为10%-14%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10-20℃；(f)对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀；(g)对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于1.5-2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌后进行离心；(h)将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子Ⅷ，其中，每10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4.5-8.5克及甘氨酸70-110克。在另一优选例中，所述肝素钠溶解液的重量是所述冷沉淀的重量的1-4倍。在另一优选例中，所述步骤a)中所述冷沉淀的溶解过程中，溶液的温度控制在25-32℃。在另一优选例中，所述步骤a)中，采用0.1-0.5mol/L盐酸调节pH值至6.1-6.5。在另一优选例中，所述步骤b)中加入20-40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地，加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，最佳地，加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液。在另一优选例中，所述步骤c)中离心分离流量为20-50L/hr，离心出液温度为12-17℃。在另一优选例中，所述步骤d)获得的混合溶液中磷酸三丁酯的浓度为0.3vol%，聚山梨酯-80的浓度为1.0vol%。在另一优选例中，所述步骤d)中将所述混合溶液置于24-26℃持续6hr，对所述混合溶液进行灭活。在另一优选例中，所述步骤e)中加入20-40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地，所述步骤e)中加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，最佳地，加入30%的聚乙二醇溶液。在另一优选例中，所述步骤f)中离心分离流量为40-70L/hr，离心出液温度为7-12℃。在另一优选例中，步骤g)中，按1：15-1：20的比例(即1重量份沉淀加入15-20重量份1.5-2.5M甘氨酸洗涤液)将所述沉淀充分溶解于1.5-2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌30-60分钟使沉淀得到充分溶解，搅拌使洗涤充分，之后于6-11℃以3000-5000转/分钟的离心速度离心10-25分钟获得洗涤后的沉淀。本专利技术中所述甘氨酸洗涤液优选为甘氨酸的水溶液。在另一优选例中，所述步骤h)中将沉淀溶解于10-20倍量（重量）的溶解液中。本专利技术中，所述溶解液优选为枸橼酸三钠及甘氨酸的水溶液。在另一优选例中，所述冷冻干燥的条件如下：升温至-45～-40℃，保持15-20小时；升温至-15～-10℃，保持10-15小时；升温至0～5℃，保持10-15小时；升温至10～15℃，保持8-10小时；升温至30℃～33℃，保持6-8小时。在另一优选例中，所述方法还包括对步骤h)获得的所述人凝血因子Ⅷ进行灭活的步骤。在另一优选例中，所述灭活是指将所述人凝血因子Ⅷ置于98-100℃水浴中30min进行干热病毒灭活处理。本专利技术的方法，保持了溶解时的活性，避免了常规方法中氢氧化铝沉淀造成的铝残留，工艺简单，适合工业化大规模生产。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式本申请的专利技术人经过广泛而深入的研究，首次研发出一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，采用肝素钠溶解液溶解冷沉淀，且采用聚乙二醇沉淀，避免了常规方法中氢氧化铝沉淀造成的铝残留，工艺简单，适合工业化大规模生产。在此基础上，完成了本专利技术。术语本专利技术中，人凝血因子Ⅷ和人凝血因子Ⅷ制品具有相同的含义，均是指本专利技术方法获得的制品。本专利技术中，冷沉淀（cryoprecipitation；cryoprecipitate；cryoprecitation）是指血浆冷沉淀中含有Ⅷ因子及纤维蛋白原。制备方法本专利技术的人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、离心分离、灭活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次离心分离、沉淀溶解、冻干及第二次病毒灭活等步骤。在本专利技术的一优选实施方式中，人凝血因子Ⅷ的制备方法包括以下步骤：(1)、冷沉淀的溶解：经粉碎的冷沉淀倒入1～4倍冷沉淀量的40～80IU/ml肝素钠溶解液内,溶解过程中溶液的温度应控制在25～32℃，搅拌至沉淀完全溶解为止;(2)、酸沉淀反应：用0.1～0.5mol/L盐酸将溶液的pH值矫正至6.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)将冷沉淀用40‑80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6.1‑6.5，溶液温度维持在20‑35℃；(b)将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为2.5%‑4.5%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20‑30℃；(c)对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液；(d)将磷酸三丁酯及聚山梨酯‑80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得到混合溶液，并对所述混合溶液进行灭活；(e)将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为10%‑14%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10‑20℃；(f)对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀；(g)对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于1.5‑2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌后进行离心；(h)将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子Ⅷ，其中，每10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4.5‑8.5克及甘氨酸70‑110克。

【技术特征摘要】
1.一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将冷沉淀用40-80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6.1-6.5，溶液温
度维持在20-35℃；
(b)将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓
度为2.5%-4.5%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20-30℃；
(c)对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液；
(d)将磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得
到混合溶液，并对所述混合溶液进行灭活；
(e)将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓
度为10%-14%(wt/vol)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10-20℃；
(f)对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀；
(g)对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于
1.5-2.5M甘氨酸洗涤液中，搅拌后进行离心；
(h)将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子Ⅷ，
其中，每10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4.5-8.5克及甘氨酸70-110克。
2.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炎，何毅明，陈红霞，薛镭，费梅芳，
申请(专利权)人：上海生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海;31