本发明专利技术涉及骨组织工程技术领域，尤其涉及一种BMP-2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，该方法包括以下的步骤：1）MSCs的原代分离培养；2）MSCs的纯化；3）MSCs的传代培养；4）构建携带huVEGF165和huBMP-2的慢病毒载体；5）huVEGF165和huBMP-2双基因修饰骨髓间充质干细胞。本发明专利技术选择BMP-2/VEGF165双基因修饰BMSCs，达到较为长期、高效的效果，避免了直接应用生长因子时可能发生的过量反应和全身性毒副作用。采用这一策略，不仅可以获取具有旺盛生理功能的种子细胞，而且利用腺病毒载体还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白利于组织构建。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及骨组织工程
，尤其涉及一种BMP-2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法。
技术介绍
随着我国经济的快速发展，由交通事故、建筑事故等创伤骨折，以及先天畸形、感染、肿瘤等各种原因造成的骨缺损、骨不愈合在临床上已十分常见，并且骨缺损患者的数量呈现出逐年上升的趋势，这些缺损畸形严重影响患者的外形美观和机体功能，其治疗特别是大段骨缺损的治疗一直是骨科领域的难题之一。传统的骨缺损修复方法主要有：自体骨移植、异体骨移植、异种骨移植，但存在诸多问题，自体取骨其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者的痛苦，而且存在供区受损，骨量受限；异体骨和异种骨又存在来源有限且价格不菲，潜在转播疾病及免疫排斥反应等一系列问题，骨水泥又存在毒性反应等一系列问题，尚不能完全解决临床脊柱外科的难题，限制了其临床应用。随着组织工程的迅猛发展,为骨缺损修复提供了新的思路和治疗途径。Crane GM（1995年）全面提出了骨组织工程的概念、方法、现状和前景，引起了广大学者的关注。骨组织工程学是组织工程学中研究较早和较多，最有潜力率先实现的组织工程之一，其可以克服传统自体骨移植的供区损伤,避免同种异体易传播疾病及异种骨的免疫排斥反应等一系列难题，骨组织工程因为其设计和制造的基本原则贯彻了骨缺损的仿生修复理念，为临床上骨缺损的修复开辟了新的方法和途径，逐渐成为国内外研究的热点之一。（Shen JY, Chan-Park MB, He B, et al.Three-dimensional micro-channels in biodegrade ablepolymeric films for control orientation and phenol type of vascular smooth muscle cells [J]. Tissue Eng,2006, 12 (8) : 2229-2240.）公开了经典意义上的骨组织工程主要包括种子细胞、支架材料、生长因子及组织工程骨的构建 等四方面的内容，构建理想的的组织工程化骨其前提就是要有生物学特性良好的种子细胞和适合的支架材料,支架材料的选择和构建是骨组织工程研究的重点和难点。理想的骨组织工程的支架材料应该满足以下几个条件: (1) 良好的生物相容性。(2) 生物可降解吸收性以及吸收速率的可调性。(3) 一定的机械强度和韧性,在特定的部位能提供与局部环境相适应的结构上的支持作用。(4)易于加工、塑行以便临床用。(5)具有三维内联多孔结构，种子细胞的黏附生长以及周围组织的长入决定了材料必须具备完备适宜的多孔性,包括一定的空隙率、孔径大小以及完善的内连接系统。(6) 材料表面有利于细胞黏附生长、分化。目前在骨组织程中常用的支架材料主要有生物陶瓷、羟基磷灰石(HAP)、人工可降解聚合物等，但至今为止，由于没有单独的一种材料在生物活性及生物力学性能上可以满足骨组织工程支架材料的要求，因此对生物材料进行改性和复合制备以求改进材料的各种性能，将各具优缺点的单纯材料按照合理的方法有机地结合起来，弥补其固有的缺陷发挥特有的优势，从而构建生物复合材料是发展的趋势所向。生物复合材料以发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足，不但可保证材料有足够的强度，而且能够更有效地结合种子细胞或生长因子，使其能更好地诱导再血管化的过程，以及通过调配具有合适的降解速度以适应于骨的构建。是一种比较理想的支架材料，现已成为研究热点。生物陶瓷以其优越的性能而备受青睐，其中研究最多的是羟基磷灰石(HA)，羟基磷灰石（Ca10(PO4)6(OH)2简称HA）是一种生物活性材料。其组织与天然磷灰石矿物相近，具有与人体硬组织相似的化学成分和结构，是脊椎动物骨和齿的主要无机成分。HA植入人体后，在体液的作用下，会发生部分降解，游离出人体组织必需的元素钙和磷，并被人体组织吸收、利用，生长出新的组织，从而使植入体和人体组织获得良好的结合。与医用生物陶瓷中的其他材料相比，虽然HA与机体亲和性最为优良：具有良好的生物相容性，骨传导性及骨诱导性，但HA单纯作为支架材料存在成形不理想、强度低、韧性差、脱粒等缺陷，HA的脆性始终限制了它作为大块骨缺损替代材料的使用，故只能应用于非承力部位。如近40年来，HA陶瓷在作为人工齿根、颌骨、耳小骨替换、脊椎骨替换、骨填充材料等方面的研究及临床应用取得了较大的成功。而HA作为修复材料的主体，与其它材料相复合形成的生物复合材料目前备受关注。通过不同性能材料的加入，使二者相互补强，进而提高HA的力学强度、韧性等问题。现已有实验表明，HA陶瓷材料中有选择地加入第二相颗粒可以显著提高材料的断裂韧性，由于第二相颗粒:如生物惰性材料ZrO2具有良好的机械力学性能，基体上复合HA，增加其生物相容性，用于承载种植体。ZrO2具有良好强度和抗生物腐蚀性。因其特殊的增韧机制，使其优于其它陶瓷材料，室温下3mol％Y2O3部分稳定的ZrO2陶瓷具有优良机械性能（抗弯强度为1200MPa）和高的断裂韧性（KⅠC达15MPa·m1/2）。将它加入到HA粉体中，烧结成块状材料后，当材料由于受到外加应力而产生裂纹时，第二相颗料能够有效地吸收能量，防止微裂纹的进一步扩展，从而提高材料的机械力学性能，达到人体承重部位的使用要求。骨组织工程中的种子细胞要求其扩增迅速,与支架材料有良好的相互作用,骨髓间充质干细胞(BMSCs) ,因其可通过体外贴壁培养分离,扩增迅速,是一类具有分化潜能的细胞,骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下可向骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞和内皮细胞等方向转化，且具有取材方便、体外扩增容易、体外增殖能力强、易于基因操作、免疫原性弱等独特优势，逐渐成为基因治疗适宜的细胞载体。利用转基因技术，可将血管生成调控因子基因导入目的细胞，使其表达某些调控因子，进而利于血管生成。所以BMSCs是一种理想组织工程种子细胞。以骨髓间充质干细胞和HA/ZrO2梯度复合材料复合构建的组织工程化骨有望成为未来骨组织工程研究和应用的主流。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前最强有力的血管生成因子，能增加微静脉、小静脉的通透性，促进血管内皮细胞分裂与增殖，使细胞质钙聚集，诱导血管生成，因此VEGF 的血管化作用是机体生理及病理性组织生长和损伤愈合的基础。而血管内皮细胞生长因子165 (VEGF165)是血管内皮细胞生长因子5种亚型之一，其活性最强，分布范围最广，是VEGF体内发挥作用的主要亚型。近年来围绕VEGF165为中心的血管再生性基因治疗研究成为国内外研究热点。另外基因工程克隆出的人类重组2型骨形态发生蛋白(recombinated homo-bone morphogenetic protein2,rhBMP-2) 的应用更能促进融合的报道也令人振奋。BMP是公认的骨诱导因子, 成熟的成骨细胞中几乎所有的骨形态发生蛋白均能够刺激碱性磷酸酶活性, 然而BMP-2是唯一能诱导多能造血干细胞和间充质干细胞中所有成骨细胞分化标志物的形态发本文档来自技高网...
【技术保护点】
BMP‑2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）MSCs的原代分离培养选用实验兔骨髓液3‑4mL，将骨髓液加入缓慢注入预先加入4mL淋巴细胞分层液的试管内,密度梯度离心,2500r/min离心30min, 离心后吸取中间的单个核细胞层，PBS洗1次，以3×105/cm2的密度接种于25cm2培养瓶内，加15%胎牛血清DMEM培养液3mL在5%CO2孵箱内37℃培养；3‑5天后半量换液；继续培养且全量每周换液2次；2）MSCs的纯化用CD14‑和CD105+双标分选纯化BMSCs； 3）MSCs的传代培养 用0.25%胰酶消化5min,即得到原代MSCS悬液, 再以1×104/cm2的密度传代培养；4）构建携带 huVEGF165和 huBMP‑2的慢病毒载体①用酶切法和测序法鉴定了 pUC18‑huVEGF165和pUC18‑huBMP‑2，保证了外源基因序列的正确性；②回收huVEGF165、huBMP‑2的目的基因，将目的基因与载体pEASY‑T1按3:1的摩尔浓度比例在37℃连接15min；③对huVEGF165、huBMP‑2与pEASY‑T1连接产物进行检测；5）huVEGF165和huBMP‑2双基因修饰骨髓间充质干细胞取第3代兔子骨髓间充质干细胞MSCs，转染前24 h细胞以5×105/孔密度接种于6孔培养板，无抗生素培养基培养，待细胞达到80%融合时准备转染；分别将粗制的Ad‑huVEGF165、Ad‑huVEGF165‑eGFP 液和Ad‑huBMP‑2、Ad‑huBMP‑2‑eGFP用无血清培养基稀释，使病毒滴度为 1～3×108pfu/ml，按 50～150pfu／细胞将病毒液加入未经消化的培养瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱内孵育 1hr，每 10min 摇晃培养板，使病毒液均匀覆盖细胞；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的细胞培养液 6ml 继续培养1~2天，获得huVEGF165和huBMP‑2双基因修饰骨髓间充质干细胞。...
【技术特征摘要】
1.BMP-2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）MSCs的原代分离培养
选用实验兔骨髓液3-4mL，将骨髓液加入缓慢注入预先加入4mL淋巴细胞分层液的试管内,密度梯度离心,2500r/min离心30min, 离心后吸取中间的单个核细胞层，PBS洗1次，以3×105/cm2的密度接种于25cm2培养瓶内，加15%胎牛血清DMEM培养液3mL在5%CO2孵箱内37℃培养；3-5天后半量换液；继续培养且全量每周换液2次；
2）MSCs的纯化
用CD14-和CD105+双标分选纯化BMSCs；
3）MSCs的传代培养
用0.25%胰酶消化5min,即得到原代MSCS悬液, 再以1×104/cm2的密度传代培养；
4）构建携带 huVEGF165和 huBMP-2的慢病毒载体
①用酶切法和测序法鉴定了 pUC18-huVEGF165和pUC18-huBMP-2，保证了外源基因序列的正确性；
②回收huVEGF165、huBMP-2的目的基因，将目的基因与载体pEASY-T1按3:1的摩尔浓度比例在37℃连接15min；
③对huVEGF165、huBMP-2与pEASY-T1连接产物进行检测；
5）huVEGF165和huBMP-2双基因修饰骨髓间充质干细胞
取第3代兔子骨髓间充质干细胞MSCs，转染前24 h细胞以5×105/孔密度接种于6孔培养板，无抗生素培养基培养，待细胞达到80%融合时准备转染；分别将粗制的Ad-huVEGF165、Ad-huVEGF165-eGFP 液和Ad-huBMP-2、Ad-huBMP-2-eGFP用无血清培养基稀释，使病毒滴度为 1～3×108pfu...
【专利技术属性】
技术研发人员：全仁夫，张亮，许世超，
申请(专利权)人：杭州市萧山区中医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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