牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的快速检测方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-3。本发明专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为4.0×10-5ng/μl；2)特异性强：采用Cycling标记的荧光探针，特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Cycleave PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48～384个样品的检测。

【技术实现步骤摘要】
牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的快速检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的 Cycleave PCR快速检测方法。
技术介绍
布氏菌病（简称布病）是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病，不仅给 畜牧业造成严重的经济损失，并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，但弱 毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗与野生菌株的鉴 另IJ，对于布病防控工作具有重要现实意义。 A19株是我国目前在用的布氏菌弱毒疫苗株之一，其鉴别包括血清抗体和病原检 测两个方面。A19为光滑型菌株，其LPS含有0-侧链，能刺激机体产生抗体，对牛有一定的 保护力，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与自然感染。病原分离鉴定，所需营 养条件复杂，分离培养需在P 2级以上生物安全实验室进行，且难以区分A19与同生物型的 其它菌株，限制其广泛应用。 近年，Real-time PCR技术发展迅速，其检测特异、敏感、操作简便，为A19的鉴别 提供了新技术手段。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP)指单个核苷 酸替代、插入或缺失而形成的分子形态，SNP位点广泛的应用于细菌耐药性基因、细菌分种 分型、病毒分型等鉴别检测中。基于Cycling荧光探针的Cycleave PCR方法可以区分SNP 位点的差异，其检测具有特异、敏感、快速以及荧光背景低、信噪比高等优势。目前，还没有 有效的基于Cycling探针鉴别A19的Cycleave PCR扩增引物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的Cycleave PCR快速检测 方法，从而弥补现有技术的不足。 本专利技术首先提供一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，引物信息如 下： ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG(SEQ ID N0:1) ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG(SEQ ID NO:2) ATT-P:GCTCACGGA(SEQ ID NO:3) 其中ATT-P的5'端用FAM进行标记；3'端用Eclipse进行标记。 本专利技术还提供一种利用上述的Cycleave PCR引物组检测A19的方法，包括有如下 的步骤： 1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取 细菌DNA ; 2) Cycleave PCR步骤：根据本专利技术设计A19的Cycleave PCR引物组，加入反应体 系中各组分。反应程序：95°C 30s ;95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s,在72°C进行FAM荧光信号 采集，进行40个循环。 3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。 另一方面，本专利技术的Cycleave PCR引物组可用于制备检测试剂盒。 本专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在1. 5h的时间里，即可完成扩增， 扩增模板的最低检出限为4. 0Xl(T5ng/μ 1 ;2)特异性强：采用Cycling标记的荧光探针， 特异性针对A19基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗 及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号； 3)操作简便：配置好的Cycleave PCR反应体系， 置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴 定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48?384个样品的检 测。 【附图说明】 图1 :阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即A19基因组的荧光扩 增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。 图2 :Cycleave PCR方法检测A19基因组DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图， 其中：曲线1-8. A19基因组DNA的质量浓度分别为40ng/y l，4ng/y 1,4. 0X10_1ng/y 1， 4· 0 X 10_2ng/ μ 1，4· 0 X 10_3ng/ μ 1,4· 0 X l(T4ng/ μ 1，4· 0 X 10-5ng/ μ 1,4· 0 X 10_6ng/ μ 1 ; 曲线9.阴性对照。 图3 :CyCleave PCR方法检测Α19基因组DNA的特异性检测荧光扩增曲线图，其 中：曲线 l，Brucella suis biovar 1 Sl33〇;曲线 2，B.suis biovar 2Thomsen;曲线3,8· suis biovar 3 686;曲线 4，B. suis biovar 4 40;曲线 5, B. abortus biovar 1 A544; 曲线 6, B. abortus biovar 2 部/8/59 ;曲线 7, B. abortus biovar 3 Tulya ;曲线 8, B. abortus biovar 4 292 ;曲线 9，B_ abortus biovar 5B31%;曲线 10, B. abortus biovar 6 870 ;曲线 11，B_ abortus biovar 7 63/75 ;曲线 12, B. abortus biovar 9C68 ;曲线 13, B. melitensis biovar 1 16M;曲线 14，B_melitensis biovar 2 63/9;曲线 15，B. melitensis biovar 3 Ether ;曲线 16, B_ ovis 63/290 ;曲线 17, B_ canis RM6/66 ;曲线 18, B. neotomae 5K33 ;曲线 19, S2 ;曲线 20, 104M ;曲线 21，M5-90 ;曲线 22, Escherichia coli K99 ;曲 线 23, Pasteurella multocida C48-1 ;曲线 24, Str印tococcus suis ST171 ;曲线 25， Pseudomonas aeruginosa DI-1 ;曲线26，阳性对照；曲线；27,阴性对照。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术的方法进行详细的描述。 一、用于检测A19的Cycleave PCR引物组的设计 牛种布鲁氏菌A19株于1923年由美国自牛奶中分离，经实验室自然传代减毒后， 成为一株毒力稳定的弱毒菌株，是我国在用的布氏菌弱毒疫苗株之一。S19是在A19的基 础上筛选出的赤藓糖醇敏感株，两者基因组比较，S19较A19存在Ery基因缺失，而我国目 前未推广S19株弱毒疫苗。本专利技术首先根据GeneBank中公布的S19全基因组序列，经与 GeneBank中其它布氏菌株全基因组序列BLAST比对，分析获得S19SNP位点，再测序鉴定 A19基因组中对应SWSNP位点处的核苷酸序列。之后，选择经鉴定存在的A19SNP位点，与 我国布氏菌地方流行株和常用布氏菌弱毒疫苗株相应SNP处核苷酸序列测序比较，验证该 SNP的A19特异性。经上述筛选，本专利技术获得Att基因上一处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，其特征在于，所述的引物组的序列信息如下：ATT‑F:CCAGAATGCGAACGGAGATG、ATT‑R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG、ATT‑P:GCTCACGGA。

【技术特征摘要】
1. 一种用于检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的引物组，其特征在于，所述的引物组的 序列信息如下： ATT-F:CCAGAATGCGAACGGAGATG, ATT-R:CTTGAGGGCCAGCAGGAG, ATT-P:GCTCACGGA。2. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的ATT-P的5'端用FAM进行标记； 3'端用Eclipse进行标记。3. 权利要求1所述的引物组在检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19中的应用。4. 一种利用权利要求1所述的引物组检测牛种布氏菌弱毒疫苗株A19的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义平，南文龙，谭鹏飞，巩明霞，张风霞，张悦勇，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37