提供了遗传修饰的非人动物和用于产生和使用它们的方法和组合物，其中所述遗传修饰包括内源低亲和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能够表达功能性FcRγ链。描述了遗传修饰的小鼠，包括从内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ链。提供了在宿主免疫系统的辅助细胞上表达至多5个低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠。
【技术实现步骤摘要】
人源化的Fc γ R小鼠 本申请是申请号为201080064262. 4、申请日为2010年12月17日、专利技术名称 为人源化的Fc Y R小鼠的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/ US2010/060925的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2009年12月21日，申请号为 61/288, 562的美国临时申请的优先权。 专利
本专利
是缺失内源鼠 Fc γ R基因的遗传修饰的非人动物，包括内源Fc γ R基 因被人Fc γ R基因替代的遗传修饰的动物，包括能够表达至少2、3、4或5种功能性人低亲 和力FcyR基因的小鼠，以及包括包含不表达内源低亲和力FcyR基因的免疫细胞的遗传 修饰的小鼠。 背景 Fc受体（FcR)是在哺乳动物的进行免疫系统的多种功能的免疫系统的细胞的表 面上发现的蛋白质。FcR以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，例如结合 附着至被感染的细胞或侵袭性病原体的抗体、刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介 导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)破坏微生物或感染的细胞。 ADCC是这样的过程：免疫系统的效应细胞裂解被抗体结合的靶细胞。该过程依赖 于对外源抗原或细胞的先行接触，从而产生抗体应答。ADCC可通过效应细胞例如天然杀伤 (NK)细胞，通过效应细胞表面上表达的FcR对本身结合至外源抗原或细胞的抗体的Fc部分 的结合来介导。由于FcR在免疫应答中起着中心作用，因此需要有共表达多种人FcR的有 用的非人动物，包括共表达多种人低亲和力FcR的非人动物。存在对用于研究和阐明人疾 病治疗（特别是抗肿瘤治疗和用于治疗自身免疫疾病的治疗）和药物开发（特别是在人抗 体药剂的开发、设计和测试中）的人FcR功能和人的ADCC过程的非人动物模型。 附图概述 图1是小鼠的野生型低未和力Fc γ R基因座的不意图，显不了小鼠 Fc γ RIIB，Fc γ RIV和Fc γ RIII基因以及用于这些基因的靶向缺失的小鼠 Fc γ R靶向载体， 其包括侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒。 图2显示了就B细胞（抗-⑶19)，NK细胞（抗-NKp46)和巨噬细胞（抗-F4/80) 门控的脾细胞的直方图，包括野生型和低亲和力FcYRa链基因缺陷型小鼠 （mFcYR K0) 的内源mFc YRII和mFc YRIII基因的表达。 图3A-3D显示了在人源化CD20小鼠（hCD20)和培育成Fc γ R敲除小鼠的人源化 0)20小鼠（hO)20/FcYR K0)中在几个淋巴细胞区室（lymphocyte compartment):骨髓（图 3A)、血液（图3B)、淋巴结（图3C)和脾（图3D)中利用具有小鼠 Fc(Ab 168)或人Fc(Ab 735)的人抗-人⑶20抗体对B细胞进行的体内耗尽。对于每一个图，y-轴显示门控的B 细胞（B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，X-轴显示每一个动物组的抗体剂量：10mg/kg 对照抗体（C)，2mg/kg人抗-人⑶20抗体（2Ab和10mg/kg人抗-人⑶20抗体（10Ab)。 图4是低亲和力小鼠 FcyR基因座的新霉素靶向缺失和用于将两个人低亲和力 Fc YR基因 （hFc YRIIIA和hFc YRIIA)插入缺失的小鼠基因座的第二靶向载体的示意性描 述，所述第二靶向载体包括侧翼连接有位点特异性重组位点的潮霉素盒。为了在血小板上 表达hFc γ RIIA，使用了可操作地连接于人Fc γ RIIIA-IIA靶向载体的hFc γ RIIA基因的延 长的启动子区域；为了阻止在血小板上表达hFcYRIIA，删除或实质上删除所述启动子区 域。 图5A显示针对NK细胞（抗-NKp46和巨噬细胞（抗-F4/80)的门控的脾细胞的 直方图，包括野生型和人？(^1?11从-1从纯合子小鼠（人？(^1?11从/^(^1?1从！10)的人 Fc YRIIIA的表达。 图5B显示针对嗜中性粒细胞（抗-Ly6G)和巨噬细胞（抗-F4/80)的门控的脾细 胞的直方图，包括野生型和人？(^1?11从-1从纯合子小鼠（人？(^1?11从/^(^1?1从！10)的 人Fc YRIIA的表达。 图6为包括两个低亲和力人Fc γ R基因 （hFc γ RIIIA和hFc γ RIIA)的插入的低 亲和力小鼠 Fc γ R基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3个额外的低亲和力人Fc γ R基 因 （hFc γ RIIB、hFc γ RIIIB和hFc γ RIIC)的第三靶向载体和侧翼连接有位点特异性重组 位点的新霉素盒的不意图。 图7显示针对B细胞（抗-CD19)和嗜中性粒细胞（抗-Ly6G)的门控的脾细胞 的直方图，包括野生型和人Fc γ RIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC纯合子小鼠（人Fc γ RIIIA/ Fc γ RIIIB/Fc γ RIIA/Fc γ RIIB/Fc γ RIIC H0)的人 Fc γ RIIB 和人 Fc γ RIIIB 的表达。 概述 提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物以及用于产生和使用它们的方法和 组合物。在不同的方面，非人动物包含人FcyR受体、内源低亲和力FcyR受体的缺失和/ 或人Fc γ R受体在内源小鼠低亲和力Fc γ R基因座上对内源Fc γ R受体的替代。 在一个方面，提供了包含功能性FcRY链的遗传修饰的细胞、非人胚胎和非人动 物，其中所述细胞、胚胎和动物包含进一步修饰，包括用一个或多个低亲和力人Fc γ R基因 序列（例如，选自 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、Fc γ RIIIB 及其组合）对低 亲和力内源非人？(^1?基因序列（例如，？(^1?118、？(^1^和？(^1?111)的替代。 在一个实施方案中，细胞、非人胚胎和非人动物为鼠。在一个实施方案中，功能性 FcRy链为小鼠 FcRy链。在一个实施方案中，小鼠 FcRy链为对于小鼠、细胞或胚胎而言 是内源性的FcRy链。 在一个实施方案中，细胞、胚胎和动物为小鼠，并且小鼠表达人低亲和力FcyR受 体的功能性α链和功能性内源小鼠 Y链。 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠不表达选自FcYRIIBa链、 FcYRIVa链、FcYRIIIa链及其组合的内源α链；其中小鼠表达功能性内源小鼠 Y链。 在具体的实施方案中，小鼠不表达功能性Fc γ RIIB a链，不表达功能性 FcyRIVa链，并且不表达功能性FcyRIIIa链。 在一个实施方案中，小鼠基因组包含内源FcYRIIBa链的缺失、内源FcYRIVa 链的缺失和内源FcYRIIIa链的缺失。 在一个实施方案中，小鼠包括内源FcYRIIBa链的缺失、内源FcYRIVa链的缺 失和内源Fc γ RIII a链的缺失，并且还包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较减 小的对抗原产生免疫应答的能力。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括减小的抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括在细胞杀伤测 定中减小的实现抗体依赖性NK细胞杀伤的能力。在具体的实施方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备包含遗传修饰的小鼠的方法，包括工程化小鼠以包含内源FcγRIIBα链基因中的纯合破坏、内源FcγRIVα链基因中的纯合破坏、内源FcγRIIIα链基因中的纯合破坏。
【技术特征摘要】
2009.12.21 US 61/288,5621. 一种制备包含遗传修饰的小鼠的方法，包括工程化小鼠以包含内源FcYRIIBa链 基因中的纯合破坏、内源FcYRIVa链基因中的纯合破坏、内源FcYRIIIa链基因中的纯 合破坏。2. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较 减小的对抗原产生免疫应答的能力。3. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包括至少50%减小的抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性（ADCC)。4. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包含功能性的FcRy链。5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中小鼠表达人⑶20。6. -种遗传修饰的小鼠细胞，其基因组包含内源FcyRIIB a链基因中的纯合破坏，内 源FcYRIVa链基因中的纯合破坏，内源FcYRIIIa链基因中的纯合破坏。7. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞包含功能性的FcRy链。8. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞是胚胎干（ES)细胞。9. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞是天然杀伤（NK)细胞。10. 如权利要求6至9中任一项所述的细胞，其中细胞包含人⑶20基因。11. 一种鼠细胞，其基因组包含以至少两个低亲和力人FcYRa链基因替代内源低亲 和力FcYRa链基因，其中细胞包含功能性内源FcRy链并且功能性地表达至少两个低亲 和力人FcyRa链基因。12. 如权利11所述的鼠细胞，其中细胞是淋巴细胞。13. 如权利要求12所述的鼠淋巴细胞，其中淋巴细胞是B细胞。14. 如权利要求12所述的鼠淋巴细胞，其中淋巴细胞是天然杀伤细胞。15. 如权利要求11所述的鼠细胞，其中细胞是鼠胚胎干细胞。16. 如权利要求11至15中任一项所述的鼠细胞，其中至少两个低亲和力人FcYRa 链基因选自下组：人FcyRIIAa链基因、人FcyRIIBa链基因、人FcyRIICa链基因、人 FcyRIIIAa链基因和人FcyRIIIBa链基因。17. 如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，涂纳新，C·古尔，S·史蒂文斯，A·J·墨菲，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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