双功能融合蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及双功能融合蛋白及其制备方法和用途。具体而言，本发明专利技术涉及包含CTLA4分子胞外区、Fc片段以及具有中和TNFα活性的功能片段的双功能融合蛋白、编码该双功能融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该双功能融合蛋白的药物组合物，所述具有中和TNFα活性的功能片段是TNFR2分子胞外区或抗TNFα单链抗体，其中CTLA4分子胞外区位于双功能蛋白的N端，TNFR2分子胞外区或抗TNFαscFv位于双功能蛋白的中间或C端。本发明专利技术的双功能融合蛋白能够同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR信号通路，从而抑制炎症反应。与使用单功能蛋白的情况相比，可降低生产成本，并减少临床给药体积和频率，提高受试者顺从性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体而言，本专利技术涉及包含 CTLA4分子胞外区、Fc片段以及有中和TNF α活性的功能片段的双功能融合蛋白、编码该双 功能融合蛋白的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞以及含有该双功能融合 蛋白的药物组合物。
技术介绍
类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢 性、进行性、系统性自身免疫性疾病，在全球人群中的发病率为0.5%-1%。其早期的症状 表现为关节的肿胀、疼痛、活动困难等。随着病情的发展，关节会严重畸形甚至致残，并且有 可能累及其它的组织和器官，引起肺间质病变、胸膜炎、心包炎、类风湿血管炎等疾病的发 生。因此，及时有效地治疗对于阻止病程的发展、缓解症状、改善患者的生活质量意义重大。 传统的RA治疗主要采用非留体类抗炎药物、糖皮质激素和缓解病情的药物。随着 RA发病机理研究的深入，越来越多的生物制剂被用于RA的治疗并展示了较传统RA治疗药 物起效更加迅速、治疗周期更短、副作用更小的优点。目前已经上市的治疗RA的生物制剂 作用于多个不同的靶点，如抑制TNF α活性的TNF α的拮抗剂、针对B细胞的单克隆抗体利 妥昔单抗（Rituximab)、抑制Τ细胞活性的阿巴他赛（Abatacept)、抑制IL-6信号通路的单 克隆抗体妥珠单抗（Tocilizumab)、中和IL-1活性的阿那白滞素（Anakinra)等（Vierboom M,Breedveld E, Hart BA. Expert opinion on drug discovery. 2012,7(4):315-325)〇 其 中，TNF α的拮抗剂是治疗RA的一线药物，所占市场份额也最大。TNF α是一种细胞炎症因 子，通过与其受体TNFR1和TNFR2结合诱导其它炎症因子的分泌。TNFa的拮抗剂能够阻 止这种结合，降低TNFa信号通路的活性，达到抑制炎症反应的目的。目前已上市的TNFa 的拮抗剂主要有可溶性的TNFa受体和TNFa单克隆抗体两类。可溶性的TNFa受体是 将TNFR2的胞外区与IgG的恒定区进行融合，如辉瑞（Pfizer)公司于1998年上市的依那 西普（Etanerc印t)。TNFa单克隆抗体类是特异识别TNFa的基因工程抗体，能够中和 TNFa ,目前已上市的有J&J的英利昔单抗（Infliximab)和戈利木单抗（Golimumab)，UCB 公司的赛妥珠单抗（Certolizumab)以及雅培（Abbott)公司的阿达木单抗（Adalimumab) (Lin J，Ziring D，Desai S，et al. Clinical Immunology, 2008, 126:13-30)。临床应用 显示，TNFa的拮抗剂可以有效地减轻RA炎症、缓解关节的放射学进展，患者ACR20指数 的改善率达50 %-70 %。但是，同时也发现有20-30 %的患者对TNFa的拮抗剂的应答 不理想，或者在接受长期的TNFa的拮抗剂治疗后，效果逐渐下降（Gibbons LJ，Hyrich KL. Biodrugs，2009, 23 (2) : 111-124)。对于这部分患者就必须使用其它作用机制的抗RA药 物进行治疗。 T细胞介导的免疫反应异常是RA的主要发病机制。研究发现RA患者的关节滑膜 液中有大量的活化的T细胞浸润。这些活化的T细胞刺激滑膜细胞分泌胶原酶和蛋白酶， 造成软骨的破坏，还刺激B细胞、内皮细胞的活化，表达针对自身抗原的抗体和炎症细胞因 子。调节和抑制T细胞的功能被认为是一种治疗RA的有效的方式（Cope AP，Arthritis research and therapy, 2008, 10 (SI) : 1-10)。Abatacept 是一种通过抑制 T 细胞激活的发 挥作用的治疗RA的生物制剂，它由百时美施贵宝公司开发并于2005年上市。Abatac印t是 将CTLA4蛋白的胞外区与IgG的恒定区进行了融合，通过阻断B7分子与⑶28的结合从而抑 制T细胞的增殖和活化。由于其机制与现有的TNFa的拮抗剂完全不同，Abatac印t被用于 中重度类风湿关节炎的治疗，特别是被推荐用于TNFa的拮抗剂治疗失败的患者。临床研 究显示，对TNFa的拮抗剂治疗效果不明显的患者使用Abatac印t治疗后，ACR20、ACR50和 ACR70指数在5年后仍可达76. 4%，51. 9%和22%，并且治疗产生的副作用很低（Genovese MC，Schiff Μ, Luggen Μ, et al. The Journal of Rheumatology, 2012,39:1546-1554)。这 一结果显示Abatacept与TNF α的拮抗剂在作用机制和效果上具有互补性。 鉴于RA对患者生活质量的巨大危害，仍然有必要研究一种结合了 TNFa的拮抗剂 和抑制T细胞增殖和活化两种作用机制的新型RA治疗药物。
技术实现思路
因此，本专利技术提供了结合了 TNFa的拮抗剂和抑制T细胞增殖和活化两种作用机 制的新型RA治疗药物。 因此，本专利技术的第一方面涉及一种蛋白，具体而言，一种双功能融合蛋白，其包含 CTLA4分子胞外区、Fc片段、中和TNF a活性的功能片段，以及连接肽。 在一个实施方案中，CTLA4分子胞外区位于融合蛋白的N端。 在一个实施方案中，所述蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、Fc片段、连接肽和 中和TNFa活性的功能片段。 在一个实施方案中，所述蛋白的连接顺序为CTLA4分子胞外区、连接肽、中和 TNF a活性的功能片段和Fc片段。 在一个实施方案中，所述CTLA4分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示。 在一个实施方案中，所述Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的FC片段以及它们 的组合和杂合体组成的组。在一个实施方案中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID N0 :2 所示。 在一个实施方案中，连接肽的氨基酸序列长度为1-50个氨基酸，例如，所述连接 肽的氨基酸序列长度为10、15、20、21、22、23、24、25或30个氨基酸，在一个实施方案中，所 述连接肽的氨基酸序列长度为1-25个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序 列长度为15个氨基酸，在一个实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0 :3所示。 在一个实施方案中，所述中和TNFa活性的功能片段为TNFR2分子的胞外区。在 一个实施方案中，所述TNFR2分子的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。在一个实 施方案中，所述中和TNFa活性的功能片段为抗TNFa的单克隆抗体或其功能片段、嵌合抗 体、人源化抗体、完全人源抗体、双特异性抗体。在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG、 IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG。 在一个实施方案中，所述功能片段为单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段（scFv)、Fab 片段或F(ab'）2片段。在一个实施方案中，所述中和TNFa活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，其氨基酸序列选自以下所述的序列：a)如SEQ ID NO：6、7、8或9所示的序列；b)如SEQ ID NO：6、7、8或9所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形成的具有同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR信号通路活性的序列；或c)与SEQ ID NO：6、7、8或9所示的序列具有至少70％同一性且具有同时阻断B7/CD28和TNFα/TNFR信号通路活性的序列。

【技术特征摘要】
2013.08.27 CN 201310379067.61. 一种蛋白，其氨基酸序列选自以下所述的序列： a) 如SEQ ID NO :6、7、8或9所示的序列； b) 如SEQ ID NO :6、7、8或9所示的序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸残基形 成的具有同时阻断B7/⑶28和TNF a /TNFR信号通路活性的序列；或 c) 与SEQ ID Ν0:6、7、8或9所示的序列具有至少70%同一性且具有同时阻断Β7/⑶28 和TNF a /TNFR信号通路活性的序列。2. -种基因，其编码根据权利要求1所述的蛋白。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :10、 11、12或13所示。4. 一种重组载体，其有效连接有根据权利要求3所述的基因。5. -种宿主细胞，其含有根据权利要求4所述的重组载体。6. -种制备权利要求1所述蛋白的方法，所述方法包括： 1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亚平，刘家望，李莹，陈国强，张磊，张笑岩，邱红娟，车美英，
申请(专利权)人：北京韩美药品有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11