本发明专利技术公开了一种茯苓NADPH氧化酶编码基因及其应用，本申请首次利用第二代SolexaHiSeq2000进行茯苓的转录组测序及Denovo拼接，分析找到茯苓中编码NADPH氧化酶的候选基因Nox并进行体外克隆表达，获得的基因序列为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.2所示。将其通过转基因技术在茯苓中过表达，发现其可加快茯苓菌核的形成及提高菌核产量。
【技术实现步骤摘要】
—种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox及其应用
本专利技术属于生物
，主要涉及茯苓中NADPH氧化酶编码基因N0x(PcWN0x)及其编码产物与应用。
技术介绍
药用茯苓是指多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos (Schw.)ffolf)的菌核，它是我国常用的大众药材品种之一，具有极高的药用价值和膳食营养价值，入药能够利水渗湿、益脾和胃、宁心安神。由于茯苓特殊的生态习性，其菌核的生长发育主要依赖于对松木的寄生并吸取其中的碳源、氮源以及其它一些必需的物质，为探索不依赖松木资源的新栽培技术、精准调控菌核形成条件及提高产量，研究茯苓菌核形成相关基因的功能及作用机理具有重要意义。 还原型烟酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate, NADPH)氧化酶的非吞卩遼细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase, N0X)家族是许多非吞卩遼细胞中活性氧(react1n oxygen species,R0S)的主要来源。通过该途径产生的ROS作为信号分子可参与细胞分化，增殖，凋亡等的调节。ROS信号转导途径在植物病原真菌的生长、发育和致病性调节方面占有非常重要的地位。PcWNox基因属于ROS信号通路中的一个基因，PcWNox基因被沉默的菌株中ROS含量明显降低，并且无法发育形成菌核。 本申请首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行获茶的转录组测序及De novo拼接。分析找到茯苓中编码NADPH氧化酶的候选基因并进行体外克隆表达，将其通过转基因技术在茯苓中过表达，发现其可加快茯苓菌核的形成及提高产量。 在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PcWNox基因及其氨基酸序列。此基因编码的酶在茯苓菌核形成过程中有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (PcffNox)，其序列为SEQ ID N0.1所示。Nox在菌核形成过程中起着必不可少的作用，该基因能够加快茯苓菌核的形成。 本专利技术另一个目的是提供Nox基因编码的蛋白质,其序列为SEQ ID N0.2所不。 本专利技术的最后一个目的在于提供一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (PcffNox)在加快茯苓菌核形成中的应用，还包括在增加药用茯苓产量中的应用。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施: 一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox(PcWNox)(以下或称PcWNox基因)，其制备方法如下: 以茯苓CDNA 作为模板，设计弓丨物 Pl:5’-ATGGGCGAGAGTTGGTT-3’ ；P2:5’ -TTAGAAGTGTTCCTTTGCGA-3’ 进行 PCR 扩增，PCR 条件如下: 3min, 95 °C ；30s 94 °C ；and 30s 57 °C，Imin 72 °C 35 个循环；10min, 72 °C ；lmin, 25 °C。 最终获得了 PcWNox基因，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQ IDN0.2所示。 一种茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (PcffNox)在加快茯苓菌核形成(提高菌核产量)中的应用，其应用过程如下: 将茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (SEQ ID N0.1所示)通过农杆菌介导遗传转化转入茯苓原生质体中，然后按常规方式进行茯苓的接种及培养，可获得高产茯苓菌核的转基因茯苓菌株。 本专利技术的所要保护的内容还包括: 编码SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。 含有本专利技术的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (PcffNox)或其ORF序列的的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本专利技术的保护范围，包括但不限于pRS 314 载体，PEXp3300, pBARGPEl, pAN7_l, pAN52_l, pBC-hygro。 含有本专利技术的茯苓NADPH氧化酶编码基因Nox (PcffNox)全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，包括但不限于大肠杆菌细胞、农杆菌细胞EA101，EA105, LBA4404、毕赤酵母。 本专利技术的茯苓NADPH氧化酶编码基因N0x(PcWN0x)的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述的茯苓NADPH氧化酶编码基因N0x(PcWN0x)全序列或其ORF序列转化获得转基因生物体，包括烟草，拟南芥，酵母，竹节参发根。 本专利技术中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。 与现有技术相比，本专利技术具有以下优点: 本专利技术所提供的茯苓NADPH氧化酶编码基因N0x(PcWN0x)是首次从茯苓植物中克隆制备所得，利用本专利技术的技术对茯苓等真菌进行基因工程改造，通过转基因来加快茯苓菌核的生长速度，同时增加其产量。NADPH氧化酶编码基因N0x(PcWN0x)参与茯苓菌核的形成，因此本专利技术为茯苓菌核形成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。 【附图说明】 图1为茯苓RNA及cDNA克隆的PCR扩增电泳图。 左图Ml为菌核形成初期，M2为菌核形成期，M3为菌核成熟期；右图为PcWNoxPCR扩增电泳图。 图2为PcWNox功能域预测分析示意图。 【具体实施方式】 本专利技术所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。 实施例1: 茯苓转录组测序及数据分析 1、样品采集 茯苓样本采集于大别山区茯苓种植基地，取其菌核立即置于液氮中速冻后，于-80°C冰箱中冷冻保存。 2、茯苓总RNA的分离和检测 取获茶(P.cocos)菌核样品0.1g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至 1.5ml离心管中，加入Iml Trizol，混匀，放置10分钟后离心10分钟，弃上清；加入200ul氯仿，震动15秒，放置2-3分钟；4°C，12000g离心15分钟，，弃上清液400ul加入600ul异丙醇，轻混后放置10分钟；4°C，12000g离心10分钟；弃上清，lml75%乙醇清洗；4°C，7500g离心5分钟；弃上清，lml75%乙醇清洗；弃上清，沉淀室温干燥10分钟后溶于25_30ul蒸馏水，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于_80°C冰箱备用。 3、转录组测序 用oligo(dT)的磁珠从总 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链,然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链,在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly (A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示。2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQID N0.1所示。4.含有权利要求2所述核苷酸的载体。5.含有权利要求4所述载体的茯苓原生质体。6....
【专利技术属性】
技术研发人员：朱闻君，赵小龙，杨涛，汤进，陈平，张绍鹏，张西锋，汪琪，李长玲，邓琛，
申请(专利权)人：朱闻君，赵小龙，杨涛，汤进，陈平，张绍鹏，张西锋，汪琪，李长玲，邓琛，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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