将冻结含水样本结合到微探针的方法技术

本发明专利技术涉及一种将在低于大约-137℃的玻璃化转变温度的温度的玻璃状生物样本结合到也保持在低于玻璃化转变温度的温度的微操纵器的方法。在现有技术方法使用利用例如丙烷或加热的针(以电阻方式加热或通过例如激光加热)的IBID的情况下，本发明专利技术使用振动的针使样本局部融化。通过停止振动，样本冻结到微操纵器。加热的部分的热容量小，并且保持在玻璃状状况的材料的量因此大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种将样本结合到微探针的方法，所述方法包括下述步骤:提供样本；提供具有末端的微探针；将该末端向样本移动，直至发生接触；在使样本的部分保持凝固的同时，使样本局部融化；以及将局部融化的样本冻结到该末端。 本专利技术还涉及一种被装备用于执行所述方法的设备。
技术介绍
从第EP2009422B1号欧洲专利知道这种方法。 已知的方法描述一种方法，其中在低温温度使具有尖锐末端的微探针与冻结含水样本(诸如，玻璃化生物样本)接触。该末端随后被临时加热到高于水的融点的温度。通过例如电阻加热或利用激光束的加热来实现该加热。在此之后，允许该末端再次冷却，作为其结果，含水样本冻结到该末端。足够快速地执行加热和冷却，以使得样本的至少部分被保持在冻结状态，更具体地讲，保持在玻璃化状态。 这种玻璃化样本可以例如是将要在电子显微镜中检查的生物组织。经常使用聚焦离子束设备从更大的部分挖出这种样本，并且然后使用微探针将这种样本运送到样本载台以用于进一步检查。 该已知方法的缺点在于:由于所述末端的加热的部分的热容量，样本的一部分融化或失去其玻璃化状态。
技术实现思路
存在如下需要:使样本的较小部分融化或者样本的较小部分失去其玻璃化状态的结合方法。 为此，根据本专利技术的方法特征在于:通过所述末端的振动来实现局部融化，当振动停止时，局部融化的样本冻结到所述末端。 通过所述末端的振动，所述末端和冻结样本彼此摩擦。这种摩擦引起冻结样本局部融化。当摩擦随后停止时，样本的融化部分随后冻结到所述末端。因为仅样本和所述末端通过摩擦被加热，所以通过摩擦产生的热量被快速地运送走，多数热量被运送到所述末端毗邻并且保持低温(低于样本材料的融点)的部分中。 要注意的是，从欧洲专利申请EP2402477A1知道另一方法。在这种已知方法中，样本被放置在设备的样本室中，所述设备装备有:聚焦离子束镜筒，产生精细聚焦的离子束；和气体注入系统，喷射具有低于样本融点的融点的气体。粘附于样本的气体分子分为键合到样本的部分和从样本室被抽走的挥发性部分。所使用的气体的例子是丙烷，在样本和末端之间产生碳键。 这种方法的缺点在于需要用于将样本结合到所述末端的离子束镜筒和气体注入系统。 在实施例中，固体样本是冻结含水样本、玻璃化含水样本或聚合物。 在电子显微镜检查中对这种样本很感兴趣，其中这种样本也称为“生物样本”。在电子显微镜检查中，这些样本包含细胞、细胞碎片、细菌、病毒、酶和蛋白质。 在优选实施例中，样本是玻璃化含水样本或玻璃化聚合物，以低于样本的玻璃化转变温度的温度提供样本，并且样本的部分在该方法中始终保持低于样本材料的玻璃化转变温度，作为其结果，样本的部分保持玻璃状。 特别地，使用该方法将玻璃化生物样本(含水样本或聚合物样本)附着于微探针证明是有效的。经常在低温电子显微镜检查(低温EM)(更具体地讲，低温透射电子显微镜检查(低温TEM))中使用玻璃化生物样本，因为玻璃化冰和玻璃化聚合物不示出能够损坏生物结构(诸如，膜)的晶体。 在又另一实施例中，所述末端是金属末端。 微探针通常装备有金属末端，例如钨或钨/镍针。 在又另一实施例中，在进行接触的同时所述末端振动。 这个实施例能够精确地观测到何时发生接触，因为随后振动的幅度改变。 在又另一实施例中，振动的频率在I和100 kHz之间。 这些是利用例如压电致动器容易实现的频率。优选地，频率被选择在接触时发生波腹处，以使得发生最大能量传递。 在又另一实施例中，振动的幅度在10和200 nm之间。 在另一实施例中，所述末端在平行于样本的表面的平面中振动。 这个实施例描述了:所述末端在样本上方摩擦，而非轻敲样本。在两种模式中都传递能量并且实现局部融化，但摩擦证明更加可控。 在又另一实施例中，在抽空的室中，更具体地讲，在带电粒子设备的样本室中，发生结合。 明显地，必须在非凝结环境中执行所述方法。尤其对于低于水的玻璃化转变温度的温度，优选抽空的室。 在另一实施例中，带电粒子设备包括电子镜筒和/或聚焦离子束镜筒。 通过使带电粒子设备装备有聚焦离子束镜筒能够使所述设备执行聚焦离子束铣削或蚀刻。虽然离子束能够被用于对样本成像并且因此被用于该过程，但由于SEM镜筒的更高信噪比及其更高的分辨率而优选SEM镜筒。 在本专利技术的一方面，用于带电粒子设备的微探针，带电粒子设备示出被装备用于保持样本的样本位置，微探针示出末端，微探针装备有用于使所述末端与样本接触的定位装置，其特征在于:所述末端被装配用于振动，所述末端在振动时使样本局部融化，当振动停止时，局部融化的样本冻结到所述末端。 在微探针的另一实施例中，所述末端被装备为被冷却到低于_50°C的温度，更具体地讲，低于玻璃状冰的玻璃化转变温度。 在又另一实施例中，一种装备有聚焦离子束镜筒和/或电子束镜筒的带电粒子设备，样本位置被装备用于在低温温度保持玻璃化生物样本，带电粒子设备装备有示出末端的微探针，微探针装备有用于使所述末端与样本接触的定位装置，所述末端被装备用于振动，所述末端在振动时使样本局部融化，当振动停止时，局部融化的样本冻结到所述末端。 在另一实施例中，带电粒子设备被装备用于将样本保持在低于_50°C的温度，更具体地讲，低于玻璃状冰的玻璃化转变温度，并且微探针的末端被装备为被冷却到低于_50°C的温度，更具体地讲，低于玻璃状冰的玻璃化转变温度。 【附图说明】 现在使用图说明本专利技术，其中相同的参考数字表示对应的特征。 为此:图1示出图示所述方法的示例性实施例的流程图，图2示出被装备用于执行根据本专利技术的方法的示例性双射束SEM/FIB系统。 这个示例性实施例被用于使玻璃化样本附着于操纵器。 【具体实施方式】 在步骤I中，在具有冷却的载物台的双射束设备中引入玻璃化工件。能够通过将薄工件投入到低温液体(诸如，丙烷)中或者通过高压冻结来制作玻璃化工件，两种方法本身都是已知的。为了使样本保持玻璃化，样本应该保持低于水的玻璃化转变温度，大约_137°C，这意味着载物台应该保持在低温并且应该存在低温罩以防止样本变热。经常利用通向保持在液氮温度的冷却散热器的编织物冷却载物台和低温罩。 在步骤2中，从工件挖出样本。通常，通过离子束铣削来实现这一点。样本经常被保持为在一个位置经桥附着到工件并且随后在稍后阶段与工件断开连接，或者替代地，将桥铣除。可在向工件引导蚀刻剂的同时执行铣削，蚀刻剂加强铣削速度或者加强沿优先方向的铣削。 在步骤3中，使微探针与样本接触。微探针可在此时已经振动。使已经振动的微探针与样本接触的优点在于:容易观测到何时所述末端与样本接触，因为这引起幅度的改变。 在步骤4中，微探针摩擦样本。要注意的是，所述末端(针)不必须表现为刚性单元并且可发生波节和波腹。应该随后观测到，在接触时，所述末端不与波节一致，因为随后在摩擦点不产生能量或产生很少的能量。 还要注意的是，通常，不能观测到融化，并且摩擦时间基于实验数据。在专利技术人执行实验的测试车辆中，在20 KHz的振动频率和50 nm的振动幅度下发现2到5秒的摩擦时间令人满意。 在步骤5中，摩擦停止，并且允许样本冻结在微探针的所述末端周围。 在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将样本(104)结合到微探针(145)的方法，所述方法包括下述步骤：•提供样本；•提供具有末端的微探针；•将所述末端向所述样本移动，直至发生接触；•在使所述样本的部分保持凝固的同时，使所述样本局部融化；以及•将局部融化的样本冻结到所述末端;其特征在于，通过所述末端的振动来实现局部融化，当振动停止时，局部融化的样本冻结到所述末端。

【技术特征摘要】
2013.06.14 EP 13172127.61.一种将样本(104)结合到微探针(145)的方法，所述方法包括下述步骤: ?提供样本； ?提供具有末端的微探针； ?将所述末端向所述样本移动，直至发生接触； ?在使所述样本的部分保持凝固的同时，使所述样本局部融化；以及 ?将局部融化的样本冻结到所述末端； 其特征在于， 通过所述末端的振动来实现局部融化，当振动停止时，局部融化的样本冻结到所述末端。2.如权利要求1所述的方法，其中所述固体样本是冻结含水样本、玻璃化含水样本或聚合物。3.如前面权利要求中任一项所述的方法，其中所述样本是玻璃化含水样本或玻璃化聚合物，以低于所述样本的玻璃化转变温度的温度提供样本，并且所述样本的部分在该方法中始终保持低于样本材料的玻璃化转变温度，作为其结果，样本的部分保持玻璃化。4.如前面权利要求中任一项所述的方法，其中所述末端是金属末端。5.如前面权利要求中任一项所述的方法，其中在进行接触的同时所述末端振动。6.如前面权利要求中任一项所述的方法，其中所述振动的频率在I和100kHz之间。7.如前面权利要求中任一项所述的方法，其中在所述末端处...

【专利技术属性】
技术研发人员：RJPG沙姆佩斯，JAHWG佩索恩，AT恩格伦，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：美国;US