本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用，一种结核分支杆菌的检测试剂盒，包括包被液；洗涤液；封闭液；终止液；抗原Rv1040c；抗原Rv2309A。本发明专利技术所述试剂盒具有操作简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，本发明专利技术利用混合抗原进行包被，克服了单一抗原在进行诊断时，存在很大的个体差异性的问题，并且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。与目前市售的同类试剂盒相比，无论是在特异性、假阳性率或是检出率上，优势更明显，本发明专利技术所述的试剂盒在检测结核分枝杆菌上具备广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
-种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，同时 还涉及该试剂盒在检测结核病药物中的应用。
技术介绍
结核病是一种严重的传染性疾病，是当今世界面临的主要公共健康问题之一，曾 在世界范围内出现过大流行。它的病原体是结核分枝杆菌，属分支杆菌属。随着比较有效的 抗结核药物的出现，结核病的发展在全球得到过充分的抑制，但是近些年来由于结核分枝 杆菌多重耐药菌株的出现，使结核病的发病率又再度回升，全球结核病形势出现了恶化趋 势。据W册统计，全球约有1/3的人口（约20亿）被结核分支杆菌感染。据我国在2000年 的第四次全国结核病流行病学的抽样调查结果估算，我国约有450万活动性肺结核病人， 每年有13万人死于肺结核，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数为世界第二。 早期的诊断治疗对于结核病的预防和治疗有着非常重要的作用，现阶段的诊断包 括姨涂片法、姨结核菌培养、X线检查和血清学检测等方法。其中，血清学检测由于其操作 简便、成本低、精确度高、操作者友好、设备简便等优点，在对结核病的检测方面应用前景非 常广阔，但是现在所使用的抗原存在着特异性差、假阳性率高的缺点，并且现在的一些商业 试剂盒检出率低、假阳性率高，因此急需研发出更为有效的特异性抗原来提高血清学检测 的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒，本试剂盒由一对混 合抗原组成，为Rvl040c和RV2309A，其序列分别为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。单 一抗原在进行诊断时，会存在很大的个体差异性，而混合抗原的出现可W克服该一缺点。并 且，混合抗原的检测效果在灵敏度，精确性和特异性方面都要优于单独抗原。 本专利技术的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核 分枝杆菌试剂中的应用，本试剂盒与商业试剂盒TB-DOT相比，其灵敏度，精确性和特异 性都要优于TB-D0T。和商业试剂盒TB-CHECK-I相比，在灵敏度和精确度方面都要优于 TB-C肥CK-I。 为了实现上述的目的，本专利技术采用W下技术措施： 本专利技术通过基因工程手段，将结核分枝杆菌Rvl040c和RV2309A蛋白在体外表达、 纯化，并将Rvl040c和RV2309A蛋白混合制备混合抗原及抗原检测试剂盒，本试剂盒能特异 性的检测结核分枝杆菌的抗体，能区分经卡介苗免疫的健康人群和被结核分枝杆菌感染的 患结核病的人群。可用于结核病的临床血清学检测。 -种检测结核分枝杆菌的试剂盒，它包括W下组份： 包被液；〇. 〇5MpH9. 6的碳酸盐缓冲液； 洗涂液：含0. 05% (v/v)吐温-20的PBS溶液； [00川封闭液：含5% (w/v )脱脂牛奶的洗涂液； 终止液；2MH2S04; 抗原Rvl040c，其序列为SEQ ID NO. 2所示； 抗原RV2309A，其序列为SEQ ID NO. 3所示。 一种结核分枝杆菌基因表达载体组氨酸标签融合表达载体祀T甜a的构建方法， 其步骤如下： (1)将商业购买的载体祀T28a上的甜a I酶切位点消除，获得一个中间载体 pET28a-A X ; (2)将步骤（1)获得的载体祀T28a-AX用限制性内切酶Nde I和化O I进行消 化； (3)利用极端嗜热古菌S. solfataricus的cdc62基因作为第一个媒介基因，通过 PCR的方法从极端嗜热古菌S. SOlfatari州S基因组中扩增获得末端含有Nde I和化0 I酶 切位点的cdc62媒介基因； (4)将步骤（3)获得的媒介基因cdc62用限制性内切酶Nde I和化0 I进行消化； (5)将步骤（2)获得的载体和步骤（4)获得.的媒介基因在16C连接过夜，得到第 二个中间载体祀T28a-62 ; (6)将步骤（5)获得的载体祀T28a-62用限制性内切酶EcoR I和化O I进行消 化； (7)利用极端嗜热古菌S. solfataricus的微型染色体维持基因MCM作为第二个媒 介基因，通过PCR方法获得末端含有EcoR I和化O I限制性酶切位点的MCM媒介基因； [002引（8)将步骤（7)获得的MCM媒介基因用EcoR I和化O I限制性内切酶消化； (9)将步骤（6)获得的载体祀T28a-26和步骤（8)获得的媒介基因MCM在16C连 接过夜。 通过W上方式获得的表达载体祀T甜a,其大小为6526bp (专利号： 化200910060952. 1)，序列为SEQ ID NO. 1所示。它还包括一个适用于克隆结核分枝杆菌所 编码基因的多克隆位点。 上述步骤（3)中的cdc62基因扩增所用引物对的序列如下： 正向引物；GCGCGGCATATGAGAATTCATGAGTGATATAATTGATGAG, 反向引物；ATATGACTCGAGTACTCCAGAGATCAGCAAACCT ; 上述步骤（7)中MCM基因扩增所需的引物对的序列如下： 正向引物；GAGCGAATTCGTTGGAAATTCCTAGTAAAC， 反向引物；GGATGGCTCGAGTCTAGACTTTTTTGTAACAT。 Rvl040c和RV2309A抗原表达载体的构建方法，其步骤是： (1)根据GeneBank提供的结核分枝杆菌册7Rv基因组序列，查出Rvl040c和 RV2309A的序列并设计引物，通过PCR得到上述两个基因。PCR结果见图1。 (2)将PCR产物分别酶切，用同样的方法酶切表达载体祀T甜a,之后将Rvl040c和 RV2309A分别和酶切过的pET表达载体连接，分别转化大肠杆菌D册a，制备质粒。质粒电 泳结果见图2。 [00巧]一种结核分枝杆菌蛋白质在大肠杆菌中的外源表达和蛋白质的纯化，其步骤是： 将得到的祀T-Rvl040c和祀T-Rv2309A转化化21 (DE3)菌株，从转化的培养皿上 挑取单菌落分别进行诱导表达，纯化。蛋白质试表达结果见图3,蛋白质纯化结果见图4。最 终得到Rvl040c和RV2309A抗原，其序列分别为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。 -种结核分枝杆菌试剂盒在制备检测结核病试剂中的应用，其步骤是： 包被液；0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液（化2〇)3 ;1. 59g;NaHC〇3 ;2. 93g;加蒸觸水定 容至1L); 洗涂液：含0. 05%(v/v)吐温-20的PBS溶液（PBS配方参见《分子克隆技术操作指 南》）； 封闭液：含5% (w/v )脱脂牛奶的洗涂液； [00川 终止液；2M恥04 ; 具体实施步骤： 1.包被；用包被液将混合抗原稀释，再用微量移液器吸取稀释好的样品加 入化ISA板内，每孔IOOy 1，4 C过夜；在每孔中加入的IOOy 1包被液中，每孔中含有 Rvl040c37 y mol,含有 Rv2309A:28 y mol。 2.洗涂；次日从4°C取出步骤I的ELISA板，甩干内容物，向孔内加入洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括以下组份： 包被液：0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液；洗涤液：含0.05% v/v吐温‑20的PBS溶液；封闭液：含5% w/v 脱脂牛奶的洗涤液；终止液：2M H2SO4；抗原Rv1040c，其序列为SEQ ID NO.2所示；抗原Rv2309A，其序列为SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1. 一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，包括以下组份： 包被液：〇. 05M PH9. 6的碳酸盐缓冲液； 洗涤液：含〇. 05% v/v吐温-20的PBS溶液； 封闭液：含5% w/v脱脂牛奶的洗涤液； 终...
【专利技术属性】
技术研发人员：何正国，张曙光，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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