一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。该亲本质粒是在出发载体pEGFP-N1-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，所述attR片段插入出发载体限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入出发载体的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。利用该亲本质粒能够快速、高效、经济地获得用于稳定整合的微环DNA，后续的转基因操作方法简单易行，具有重要的生物学意义及实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
-种获得微环DNA的亲本质粒及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种获得微环DNA的亲本质粒及其应用。
技术介绍
微环DNA载体（Minicircle DNA Vector)是一种超螺旋的DNA分子，它 是亲本质粒（Parental Plasmid, PP)发生位点特异性重组的产物。在重组酶的 作用下，亲本质粒转变为两个环状DNA，一个含有大量的细菌骨架序列，称为微质 粒（Miniplasmid，MP);另一个则是仅含有目的基因的真核表达框架，即微环DNA (Minicircle，MC)。与传统质粒载体相比，微环DNA作为载体具有安全性好、携带的目 的基因表达水平高、转基因表达持续时间长等优点（Darquet AM, Cameron B，Wils P，et al. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery:supercoiled minicircle. Gene Ther,1997, 4:1341-1319. Chen ZY,He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther, 2003, 8:495-500.Bigger Bff, Tolmachov 0, Collombet JM, et al.An araC-controlled bacterial ere expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy. J Biol Chem, 2001, 276:23018-23027.)。 已有报道利用LR克隆酶（Invitrogen, Cat. No. 11791-020)成功获得微环DNA 载体（Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al.Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Pro Natl Acad Sci U S A, 2011，108 (19) : 7902-7907)。上述报道方法为：构建亲本质粒时连入attL和attR片段， 在体外LR克隆酶的作用下attL和attR片段发生重组，生成微质粒和微环DNA，微质粒在 限制性内切酶作用下被破坏，最后通过切胶回收获得微环DNA，然而该方法存在如下缺点： 1、LR克隆酶价格昂贵，200 μ 1体系用量大，成本较高；2、微环DNA经过胶回收纯化得到，损 失大，获得量少；3、步骤繁琐，LR反应后还要进行限制性酶切将微载体破坏，造成后续微环 DNA纯化回收的困难。因此很有必要对如何高效、快速、经济地利用LR克隆酶获得微环DNA 载体的方法进行研究。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对目前利用LR克隆酶获得微环DNA的步骤 较繁琐以及微环DNA获得量较低的缺陷，提供一种获得微环DNA的亲本质粒及其转基因的 方法和应用，利用本专利技术所述的亲本质粒可以高效、快速、经济地得到微环DNA，并且高效、 快速地获得转基因细胞株。 为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一为：一种获得微环DNA的亲 本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体pEGFP-Nl-attB质粒中插入attR 片段和attL片段以及OC31整合酶基因表达盒构建而成，其中所述attR片段插入 pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Spe I和Dra III的酶切位点之间，所述attL片段插入 pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III和Ase I的酶切位点之间，所述OC31整合酶基 因表达盒插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III的酶切位点。 其中所述表达盒为本领域常规表达盒，所述表达盒较佳地包括合适的转录调节序 列，以及转录终止信号，还包括有助于实现表达或实现表达所需的其他因子，如表达增强子 元件。其中所述OC31整合酶基因表达盒较佳地为链霉菌噬菌体Φ031整合酶基因表达盒， 所述表达盒或其他外源基因表达盒在亲本质粒的位置为任何位置，只要不影响该亲本质粒 的其他功能以及外源基因的表达即可。 其中所述转录调节序列是指调节与其连接的核酸序列转录的具有调控功能的核 酸序列。当转录调节序列控制并调节核酸序列的转录和/或翻译时，所述转录调节序列可 操作地连接于所述核酸序列。转录调节序列，或表达控制序列较佳地包括启动子、增强子、 内部核糖体进入位点、转录终止子、位于蛋白编码基因前的起始密码子、内含子剪接信号以 及终止密码子。 其中所述转录调节序列是指核酸序列，其功能是控制一个或多个编码序列的 转录，并且对于编码序列的转录起始位点的转录方向而言位于其上游，并且在结构上由DNA 依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列决定，包括但不限于转录因 子结合位点、阻遏和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的作用是直接或间接调节 由启动子转录的任何其他核酸序列，包括衰减子、增强子或者沉默子。其中所述启动子较佳 地包括组成型启动子，诱导型启动子和/或组织特异性启动子。其中所述组成型启动子是 在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。诱导型启动子是受到生理或 发育调节的启动子，例如通过应用化学诱导剂进行调节的启动子。组织特异性启动子仅在 特定类型的组织或细胞中有活性。本专利技术所述OC31整合酶基因表达盒中的启动子为常规 启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为PGK启动子；其中所述外源基因表达盒中的启动子 为常规启动子，较佳地为真核启动子，更佳地为CMV启动子。 其中所述OC31整合酶基因为常规的OC31整合酶基因，所述OC31整合 酶基因较佳地为小鼠密码子优化的OC31整合酶基因 （Raymond CS and Soriano P. High-efficiency FLP and PhiC31site-specific recombination in mammalian cells. PLoS one, 2007, 2:el62.)或者链霉菌噬菌体OC31整合酶。其中所述attL片段与 attR片段为本领域常规核酸序列，所述attR片段和attL片段较佳地是指λ噬菌体的attP 位点和细菌基因组中attB位点发生定点重组后产生的核酸序列。所述attL片段与attR 片段的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成序列即得。 本专利技术所述attR片段的制备方法较佳地为：利用attR-up引物和attR-down引 物，以attR单链序列和attRrc单链序列为模板，进行PCR反应即得。 其中所述attR-up引物的序列较佳地如序列表中SEQ ID NO: 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体pEGFP‑N1‑attB质粒中插入attR片段和attL片段以及ΦC31整合酶基因表达盒构建而成，其中所述attR片段插入pEGFP‑N1‑attB质粒的限制性内切酶SpeⅠ和DraⅢ的酶切位点之间，所述attL片段插入pEGFP‑N1‑attB质粒的限制性内切酶AflⅢ和AseⅠ的酶切位点之间，所述ΦC31整合酶基因表达盒插入pEGFP‑N1‑attB质粒的限制性内切酶AflⅢ的酶切位点。

【技术特征摘要】
1. 一种获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述亲本质粒是在真核表达载体 pEGFP-Nl-attB质粒中插入attR片段和attL片段以及OC31整合酶基因表达盒构建而成， 其中所述attR片段插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Spe I和Dra III的酶切位点 之间，所述attL片段插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III和Ase I的酶切位点 之间，所述OC31整合酶基因表达盒插入pEGFP-Nl-attB质粒的限制性内切酶Afl III的酶 切位点。2. 如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述attR片段为λ噬菌 体attR片段，所述attL片段为λ噬菌体attL片段。3. 如权利要求1所述获得微环DNA的亲本质粒，其特征在于，所述ΦC31整合酶基因表 达盒中的启动子片段为PGK启动子片段。4. 一种包含如权利要求1?3任一项所述获得微环DNA的亲本...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晴雯，刘浏，曾凡一，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，上海滔滔转基因工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31