利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序制造方法及图纸

提供一种能够在基于利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量逐个检测单个粒子的扫描分子计数法的单个粒子检测技术中，在非发光粒子和发光粒子混合存在的样本溶液中分别识别并检测非发光粒子和发光粒子的存在的技术。关于本发明专利技术的检测样本溶液中的单个粒子的技术，一边使显微镜的光检测区域的位置在包含非发光粒子和发光粒子的样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据，将时序光强度数据中相对于背景光强度的光强度的增大检测为表示发光粒子的存在的信号，将相对于背景光强度的光强度的下降检测为表示非发光粒子的存在的信号。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序
本专利技术涉及一种单个粒子检测技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统测量依赖于单个粒子的存在的光强度的变化来检测单个粒子并进行各种分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序。
技术介绍
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析计数。作为这样的光分析技术，例如已知有突光相关光谱分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献1_3、非专利文献1-3)、突光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1nAnalysis:FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon CountingHistogram:PCH。例如专利文献5)等。另外,在专利文献6?8中提出了一种根据使用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。 并且，本申请的 申请人:在专利文献9?11中提出了一种利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的、基于与FCS、FIDA等光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在上述的FCS、FIDA等光分析技术的情况下，如果清楚地进行描述则是，针对通过连续地测量来自浮游于作为样本溶液内的光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的荧光分子的光而得到的光强度数据执行统计性的运算处理，从而检测荧光分子的浓度和/或其它特性。与此相对，在专利文献9?11所提出的新的光分析技术中，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发出光的粒子(发光粒子)时逐个检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐一地进行检测来进行发光粒子的计数、获取与样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十UL左右)，另外，测量时间短(在一次测量中反复进行多次秒级时间的测量。)，并且能够在作为观测对象的粒子的浓度低于FCS、FIDA等光分析技术能够良好地进行测量的水平(InM左右)的样本溶液中检测发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。因而，期待“扫描分子计数法”在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查且能够检测无法良好地执行FCS、FIDA等的程度的更低浓度的粒子的浓度和/或特性的强力工具。 专利文献1:日本特开2005-098876 专利文献2:日本特开2008-292371 专利文献3:日本特开2009-281831 专利文献4:日本特许第4023523号 专利文献5:国际公开2008-080417 专利文献6:日本特开2007-20565 专利文献7:日本特开2008-116440 专利文献8:日本特开平4-337446号公报 专利文献9:国际公开第2011/108369 专利文献10:国际公开第2011/108370 专利文献11:国际公开第2011/108371 专利文献12:国际公开2010-119098 非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438页1999年 非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence Correlat1nSpectroscopy)、R.Rigler 编、Springer、柏林、2000 年、204-224 页 非专利文献3:加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、N0.2,271-277页 非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))
技术实现思路
专利技术要解决的问题 另外，在如上所述的扫描分子计数法中使用的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的情况下，由于光轴方向的分辨率高于普通的光学显微镜，因此在从共焦区组织(光检测区域)释放出有意义的背景光的情况下，当不发光的单个粒子通过共焦区组织的内部时，观测到来自共焦区组织的光强度的下降(专利文献12)。因此，本申请的 申请人:在日本特愿2011-184635中提出了如下一种“反转型扫描分子计数法”:使用不发光的单个粒子作为观测对象粒子，利用与通过光检测区域扫描释放出实质固定的背景光的样本溶液内的“扫描分子计数法”同样的方法进行光的检测，检测不发光或发光强度低于背景光的单个粒子被包含在光检测区域内时的单个粒子的光强度的下降，从而检测单个粒子的存在。根据所述的“反转型扫描分子计数法”，能够检测低浓度的不发光的单个粒子。 另外，根据本专利技术的专利技术人等的研究发现，如上述的“反转型扫描分子计数法”的情况那样，即使在来自共焦区组织的光中存在有意义的背景光，如果来自发光粒子的发光强度高于背景光，则也能够逐个检测单个发光粒子所释放的光。因而，在包含在检测光波长下不发光或发光强度低于背景光的单个粒子(以下称为“非发光粒子”。)和在检测光波长下发光强度高于背景光的单个发光粒子的溶液中，如果进行依照扫描分子计数法的光测量，贝1J与非发光粒子对应的信号(光强度的变化)表现为向下凸，与发光粒子对应的信号表现为向上凸。即，在这种情况下，能够同时且相互区分地检测包含在同一样本溶液中的非发光粒子和发光粒子各自的存在。在本专利技术中，有利地利用所述知识。 这样，本专利技术的主要课题在于提供一种在检测光波长下不发光或发光强度低于背景光的单个粒子(非发光粒子)和在检测光波长下发光强度高于背景光的单个粒子(发光粒子)包含在同一样本溶液内的情况下能够利用扫描分子计数法的原理来识别并检测非发光粒子和发光粒子各自的存在的单个粒子检测技术。 用于解决问题的方案 根据本专利技术的一个方式，通过下述单个粒子检测装置来达成上述课题，该单个粒子检测装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单个粒子检测装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动；光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号，其中，由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的增大，上述第二单个粒子的上述信号为在上述第二单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的下降。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.18 JP 2012-0945031.一种单个粒子检测装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号， 其中，由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的增大，上述第二单个粒子的上述信号为在上述第二单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的下降。2.根据权利要求1所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 上述信号处理部对逐个检测出的表示上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的存在的信号的个数分别进行计数，来对在上述光检测区域的位置移动的过程中检测出的上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的个数进行计数。3.根据权利要求1或2所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 从每单位体积的上述第一单个粒子释放的发光强度超过从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度，从每单位体积的上述第二单个粒子释放的发光强度低于从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度。4.根据权利要求1?3中的任一项所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 上述背景光是由在上述样本溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光，或是照明光。5.一种单个粒子检测方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测方法的特征在于，包括以下过程: 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据；以及 在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号， 其中，检测出的来自上述光检测区域的上述光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶梨拓哉，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP