基于颜色的逆转录等温扩增技术检测肠道病毒基因组5’-UTR制造技术

本发明专利技术属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，手足口病检测网络实验室，哨点医院等用于对手足口病疑似病患咽拭子、肛拭子、脑脊液、疱疹液、粪便等标本的肠道病毒感染的检测和监测。具体是应用基于颜色的逆转录等温扩增技术(RT-GEAR)，通过计算机软件分析肠道病毒基因组5’-UTR的保守序列，分别设计出四条引物完全与识别基因靶序列中五个结合区匹配，并于反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在63℃等温环境中扩增1小时，最后用肉眼观察染料颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的病毒分离、血清学检测、RT-PCR方法等比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。

【技术实现步骤摘要】
基于颜色的逆转录等温扩增技术检测肠道病毒基因组 5, -UTR 专利
本专利技术是用基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术（Reverse transcription isothermal genome exponential amplification reaction,RT-GEAR)检测人感染肠道病 毒基因组5'端非翻译区（5' -Untranslated region，5' -UTR)。用于各级疾病预防控制机 构，手足口病检测网络实验室，哨点医院对人感染肠道病毒的检测和监测。 专利技术背景 肠道病毒感染广泛分布于全球各地，人的一生中往往会经历多次感染。肠道病毒 可直接引多种疾病，如手足口病、脊髓灰质炎、无菌性脑膜炎、疱疹性咽峡炎、结膜炎、流行 性肌痛、甲型肺炎等。2008年以来，由肠道病毒引起的手足口病出现大规模流行，发病人数 呈快速上升趋势,范围遍及全国，引起国家和社会的广泛关注。 手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿 童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、 口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻 痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。引起手足口病的 病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、肠道病毒71型 (Enterovirus71，EV71)、埃可病毒等18种肠道病毒血清型。为有效阻止疫情的爆发和发生疫情后的应急处置，根据卫生部应对手足口疫情防 控要求，我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将 网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行病毒检测的 能力，及早发现可能出现人传人病例，切实做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的 基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术检测人感染肠道病毒基因组5'-UTR方法，将为提高我 国疾病监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对手足口病人的快速筛查提供了有力 的技术保障。基于HNB颜色的逆转录等温扩增技术（RT-GEAR)在RNA病毒的检测方面应该有着 传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性 和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检 测时间可以缩短到1小时以内，灵敏度可达到检测1000个拷贝以上的病毒核酸分子。除了 应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项 检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作,减少了污染机会并方便了实验过程 中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反 应在 63°C等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了 RNA 酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在四条引物完全与识别的靶序列中五个结 合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景， 从而使检测特异性得到改善。第四，RT-GEAR的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色 沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内 颜色的变化，可以直接判定检测结果。
技术实现思路
： 1.本专利技术是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵 敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，检测时间短灵敏度高。整个检测时间 可缩短至1小时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。其次，特异性高。所设计的四条特 异性引物，只在其与识别靶序列中五个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行。然后， 所有的扩增过程都可在63°C等温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。最后，污 染机会低和结果可视化。。 2.选择肠道病毒基因组5'-UTR(Untranslated region，非翻译区）的相对保守区 设计相应的RT-GEAR引物，针对每个基因分别包括两条嵌合引物（FT、BT)和两条加速引物 (IF、IR)。所有引物的具体序列见表1。 表1 :逆转录等温扩增技术检测肠道病毒基因组5' -UTR的引物序列 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肠道病毒感染的检测，基于HNB(羟基萘酚蓝)颜色的逆转录等温扩增技术(RT‑GEAR)，其中包括：用于肠道病毒基因组5’‑UTR(Untranslated Region，非翻译区)检测的4条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝)染料。所述引物序列为： panEV‑FT：5’‑GTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCT‑3′ panEV‑BT：5’‑CCCTGAATGCGGCTAATCCTAACGAAACACGGACACCCAAA‑3′ panEV‑IF：5’‑GCCGGAGGACTACTAACT‑3′ panEV‑IR：5’‑GCAGCGGAACCGACTAC‑3′。

【技术特征摘要】
1. 一种用于肠道病毒感染的检测，基于HNB(羟基萘酚蓝）颜色的逆转录等温扩增技术 (RT-GEAR)，其中包括：用于肠道病毒基因组5' -UTR(Untranslated Region，非翻译区）检 测的4条寡核苷酸引物和HNB(羟基萘酚蓝）染料。所述引物序列为： panEV-FT ：5, -GTTAGGATTAGCCGCATTCAGGGGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCT-3; panEV-BT ：5, -CCCTGAATGCGGCTAATCCTAACGAAACACGGACACCCAAA-3; panEV-IF :5' -GCCGGAGGACTACTAACT-3' pan...

【专利技术属性】
技术研发人员：马学军，聂凯，许文波，张勇，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11