一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组毕赤酵母工程菌及将其用作全细胞催化剂合成莱鲍迪苷A的方法。本发明专利技术的重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQIDNO.3所示，编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQIDNO.4所示。本发明专利技术的重组毕赤酵母工程菌实现Sus1的胞内表达和UGT76G1的表面展示表达，将本发明专利技术重组毕赤酵母用作全细胞催化剂可有效地用于合成莱鲍迪苷A，不仅提高了莱鲍迪苷A的合成效率和原料使用率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A的生产加工开辟新的工业化途径。

【技术实现步骤摘要】
一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其在合成莱鲍迪苷A中的应用。
技术介绍
甜菊糖（Steviolglycoside）是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，限制其应用。甜菊苷（Stevioside）和莱鲍迪苷A（RebaudiosideA）是甜菊糖中含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10%和2-4%。莱鲍迪苷A(RA)是一种无毒、安全、低热能、高甜度的天然甜昧剂，其甜度是蔗糖的150-300倍，热值仅为蔗糖的1/300，而且口味纯正，没有后苦味；因而具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法有：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性，但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。那么，是否能够从莱鲍迪苷A(RA)的生物合成途径入手，结合基因工程技术、构建一种以相应底物为基础，通过发酵高效合成莱鲍迪苷A(RA)的工程菌，并将其运用于莱鲍迪苷A(RA)的合成加工领域，以提高莱鲍迪苷A(RA)的合成效率、节约生产成本，并为莱鲍迪苷A(RA)的生产加工开辟新的工业化途径就显得十分必要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌及其构建方法。本专利技术所解决的技术问题还在于将共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母工程菌作为全细胞催化剂用于合成莱鲍迪苷A。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：编码蔗糖合成酶基因的DNA序列如SEQIDNO.3所示，编码UDP-糖基转移酶的DNA序列如SEQIDNO.4所示。其中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶基因的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶的DNA序列。优选地，所述胞内表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1。另外，本专利技术还提供了一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码序列如SEQIDNO.3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码序列如SEQIDNO.4所示；步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌；或者，将将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌；再将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌。优选地，所述胞内表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1。优选地，所述步骤三具体包括：将表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化PichiapastorisGS115感受态细胞，并在MD平板上筛选阳性转化子，从而得到工程菌GS115/UGT76G1；再将胞内表达载体pPICZA-Sus1经PmeI单酶切线性化并纯化后电转化上述GS115/UGT76G1感受态细胞，并在博来霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进而得到重组毕赤酵母工程菌GS115/Sus1-UGT76G1。另外，本专利技术还提供了一种全细胞催化剂，包含本专利技术的重组毕赤酵母工程菌。优选地，所述全细胞催化剂是通过如下步骤制备而成：（1）挑取上述重组毕赤酵母工程菌接种至BMGY培养基进行初级培养至OD600接近5.0-6.0，离心收集细胞；（2）然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近0.5-1.0，于25-35℃条件下进行次级培养，次级培养过程中每天补加终浓度1%甲醇，发酵3天后在离心回收菌体；（3）菌体冻干后即得到含重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂。另外，本专利技术还提供了一种莱鲍迪苷A的合成方法，该方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷为原料，以本专利技术的全细胞催化剂为催化剂合成莱鲍迪苷A。优选地，该方法包括如下步骤：（1）按如下组分及其浓度制备反应体系；50mMPBS缓冲液，3mMMgCl2，250mM蔗糖，0.5-1mMUDP，3mg/mL甜菊苷；（2）向反应体系中加入菌体量为30OD含有重组毕赤酵母工程菌的全细胞催化剂，于37℃进行反应12h后终止反应；（3）每200ul反应液用600ul正丁醇萃取反应体系中的莱鲍迪苷A，吸取上层正丁醇萃取液而后进行纯化分离得到莱鲍迪苷A。与现有技术相比，本专利技术优点在于：本专利技术构建得到的重组毕赤酵母工程菌能同时实现蔗糖合成酶Sus1的胞内表达和UDP-糖基转移酶UGT76G1的表面展示表达。而从原理上讲蔗糖合成酶Sus1能够将蔗糖的糖基转移至UDP上生成UDPG和果糖，而UDP-糖基转移酶UGT76G1能特异性地催化ST苷和UDPG反应合成RA。因此，利用本专利技术共表达蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的重组毕赤酵母能有效地将上述两步反应联合起来，以甜菊苷（ST）为原料、蔗糖为糖基供体，进行生物转化高效合成合成莱鲍迪苷A（RA）。由本专利技术具体实施例中的实验结果也充分表明采用本专利技术方案发酵获得的全细胞催化剂可高效合成莱鲍迪苷A(RA)，其底物ST的转化率达到95%以上，产量超过93%，不仅提高了莱鲍迪苷A(RA)的合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示，编码UDP‑糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌是通过将含有如下外源DNA的表达载体线性化后转化毕赤酵母而获得：编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列如SEQIDNO.3所示，编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列如SEQIDNO.4所示;所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQIDNO.4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1。2.一种重组毕赤酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、编码基因的获取：以蔗糖合成酶Sus1和UDP-糖基转移酶UGT76G1的氨基酸序列为基础，对序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到密码子优化的对应编码序列；其中，蔗糖合成酶Sus1氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码序列如SEQIDNO.3所示；UDP-糖基转移酶UGT76G1氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码序列如SEQIDNO.4所示；步骤二、表达载体的构建：将步骤一获取的编码基因分别接入毕赤酵母的表达载体中，所述表达载体包括胞内表达载体和表面展示表达载体，所述胞内表达载体克隆有编码蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述表面展示表达载体克隆有编码UDP-糖基转移酶UGT76G1的DNA序列；所述胞内表达载体是将如SEQIDNO.3所示的DNA序列克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZA而获得胞内表达载体pPICZA-Sus1；所述表面展示表达载体是将如SEQIDNO.4所示的DNA序列与锚定蛋白Gcw61编码基因融合后克隆至巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K而获得的表面展示表达载体pGCW61-UGT76G1;步骤三、表达载体转化及重组毕赤酵母工程菌获取：将表面展示表达载体经酶切线性化并纯化后电转化至感受态细胞，并在选择培养基上筛选阳性转化子，从而得到初级重组毕赤酵母工程菌，再将胞内表达载体经酶切线性化并纯化后电转化初级重组毕赤酵母工程菌的感受态细胞，并在选择培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：林影，梁书利，毛国红，刘晓肖，王蓓蓓，
申请(专利权)人：广州康琳奈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44