一种透明质酸固相包被方法技术

本发明专利技术提供了一种透明质酸的包被方法，由以下步骤组成：(1)透明质酸用强酸水解，使用的酸过量；(2)用NaOH中和多余的酸，所述的NaOH浓度为0.5-5mol/L；(3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐；(4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2-8℃，震荡反应4h；(5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素；(6)将链霉亲和素包被到固相载体上；(7)将标有生物素的透明质酸链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。本发明专利技术的优点是：生物素化的透明质酸与链霉亲和素固化更稳定，且采用二次包被生物素，结构比以试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种透明质酸的包被方法，由以下步骤组成：(1)透明质酸用强酸水解，使用的酸过量；(2)用NaOH中和多余的酸，所述的NaOH浓度为0.5-5mol/L；(3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐；(4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2-8℃，震荡反应4h；(5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素；(6)将链霉亲和素包被到固相载体上；(7)将标有生物素的透明质酸链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。本专利技术的优点是：生物素化的透明质酸与链霉亲和素固化更稳定，且采用二次包被生物素，结构比以试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。【专利说明】-种透明质酸固相包被方法
本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供。
技术介绍
[000引透明质酸曲aluronan，HA)是一种产生于间质细胞的氨基多糖，由N-已醜氨基 葡萄糖及D-葡萄糖酵酸的重复结构组成的线形多糖结构。分子式；（CuHwNNaOjn，分子量 4, 000-8, 000万，由肝内皮细胞摄取、降解，其广泛存在于结缔组织、皮肤、关节液及玻璃体 液中，是结缔组织基质的主要成份之一，是反映肝脏内皮细胞功能和活动性纤维化的良好 指标。 透明质酸（HA)定量检测试剂盒的免疫反应系统采用竞争法原理，将透明质酸 (HA)与生物素偶联后，将其包被于偶联有链霉亲和素的固相载体上（固相包括微孔板、磁 微粒、酶标板等）。校准品或样品中的HA与固相上的HA竞争结合辣根过氧化物酶标记的透 明质酸结合蛋白，充分反应后，洗掉游离成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化 鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于 第5-15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与样本HA浓度呈负相关。样本中 的HA浓度依据由校准品HA浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清 中的HA含量。 对于生物素标记的透明质酸包被于偶联有链霉亲和素的固相载体上，得到组合物 不稳定，影响检测结果的准确性与精密性，针对此问题，本专利技术提供了一种新的包被方法， 使包被物更稳定，检测结果更可靠。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供，该方法采用二次包被生 物素，结构比W试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。解决了生物素标记 的透明质酸包被于偶联有链霉亲和素的固相载体时得到组合物不稳定，影响检测结果的准 确性与精密性的问题。本专利技术提供的技术方案是： -种透明质酸固相包被方法，其特征在于，由W下步骤组成： (1)透明质酸用过量强酸水解； [000引 似用化OH中和多余的酸； (3)用测酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐； (4)用N服活化的生物素和处理过的透明质酸反应；反应条件为；避光，2-8。震 荡反应化。 (5)用磯酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素； (6)将链霉亲和素包被到固相载体上； (7)将标有生物素的透明质酸与链霉亲和素包被的固相共同赔育，赔育温度 37 C，赔育时间Ih。 进一步，步骤（I)中所述的强酸是硫酸、盐酸、硝酸、高猛酸或高氯酸。 进一步，步骤（1)中所述强酸为盐酸，浓度为0. 5-1. 5mol/L。 [001引 进一步，步骤（2)所述的化OH浓度为0. 5-1. 5mol/L0 进一步，步骤（6)所述的固相载体为酶标板、发光板或磁微粒。 本专利技术的优点是；透明质酸很难直接生物素化，使用强酸水解后，将N-己醜葡糖 胺水解成葡糖胺；使生物素化的透明质酸与链霉亲和素固化更稳定，且采用二次包被生物 素，结构比W试剂形式添加的生物素更稳定，同时也缩短了反应时间。本专利技术显著提高了透 明质酸定量检测结果的精密性和可靠性，增强了试剂盒的稳定性。 【具体实施方式】 [001引 实施例1 : 1、透明质酸的处理： [00川 （1)称取Smg透明质酸溶于Iml蒸觸水中； [002引 似加入0. Imll. Smol/L盐酸，2-8°C反应过夜； 做加入 0. Imll. Smol/L NaOH,中和至中性； (4)测酸盐缓冲液透析2小时W除去多余的盐离子； [002引 2、N服活化的生物素和处理过的透明质酸反应： (1)取 0. 5mgN服-LC-LC-Biotin 溶于 0. 5ml 蒸觸水中；将 Biotin 溶液加入 水解后的透明质酸溶液中，暗置振荡反应4小时，得到HA-Biotin复合物、未结合的 畑S-LC-LC-Biotin混合溶液； 似称取53. 5mg畑典1溶解到Iml蒸觸水中，配制成Imol/LNACl溶液； [002引 做将似巧幌的溶液加入到（1)中，在避光条件，2-8C下，震荡反应化； (4)用磯酸盐缓冲液于2-8C透析2化，得到HA-Motin复合物。 4、链霉亲和素固相包被： (1)将链霉亲和素按照2yg/ml的浓度包被到白色聚苯己帰塑料板上，每孔 IOOuL 37 °C条件下反应化； (2)洗板；用tris-tween洗液洗涂3次，甩干； 5、HA-biotin 复合物二次包被： (1)将HA-biotin复合物加入链霉亲和素包被板中，每孔100uL，37°C反应1小时； (2)洗板；用tris-tween洗液洗涂3次，甩干； [003引 做用含有1%牛血清白蛋白的蛋白溶液进行封闭，每孔加入200uL封闭液，37°C 反应化，弃去孔内封闭液，甩干； (4)将包被板置于37C烘箱化，即完成透明质酸在固相塑料板上的包被，之后用 铅铅袋密封，存放于-2(TC保存备用。 [003引实施例2 ;包被板加速稳定性试验 用本专利技术的方法包被96孔发光板，包被H批，每批分成两部分，一部分放置于4C 冰箱，一部分放置于37C做加速稳定性，于7天后取出，平衡至室温，测校准品、企标、质控 品，检测包被板的精密性、灵敏度、线性，W判断其稳定性。实验结果如下表： 【权利要求】1. ，其特征在于，由以下步骤组成： (1) 透明质酸用强酸水解，使用的酸过量； (2) 用NaOH中和多余的酸； (3) 用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐； (4) 用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2-8°C，震荡反应4h ; (5) 用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素； (6) 将链霉亲和素包被到固相载体上； (7) 将标有生物素的透明质酸与链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37°C，孵 育时间lh。2. 根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤⑴中所述的 强酸是硫酸、盐酸、硝酸、高锰酸或高氯酸中的一种。3. 根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤⑴中所述强 酸为盐酸，浓度为〇· 5-5mol/L。4. 根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤⑴中所述强 酸为盐酸，浓度为1. 5mol/L。5. 根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤（2)所述的 NaOH 浓度为 0· 5-5mol/L。6. 根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤（2)所述的 NaOH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透明质酸固相包被方法，其特征在于，由以下步骤组成： (1)透明质酸用强酸水解，使用的酸过量； (2)用NaOH中和多余的酸； (3)用硼酸盐缓冲液进行透析或层析柱脱盐； (4)用NHS活化的生物素和处理过的透明质酸反应，避光，2‑8℃，震荡反应4h； (5)用磷酸盐缓冲液透析或层析柱除去未结合的生物素； (6)将链霉亲和素包被到固相载体上； (7)将标有生物素的透明质酸与链霉亲和素包被的固相共同孵育，孵育温度37℃，孵育时间1h。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，栾大伟，张振斌，陈露鸾，侯玉文，杨桂霞，黄新城，刘靳波，
申请(专利权)人：博奥赛斯天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12