NDM-1 锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了NDM-1锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用，具体是设计锁核酸修饰探针，固定在电极表面为特异性探针，其中锁核酸探针的5’端修饰有巯基，通过Au-S键的化学键合可将其固定到电极表面，锁核酸探针与目标基因的部分序列相互补，本发明专利技术获得的电极为多重耐药菌的检测提供了全新思路和检测手段。

【技术实现步骤摘要】
NDM-1锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用
本专利技术属于电化学检测领域，具体涉及NDM-1锁核酸(Lockednucleicacid，LNA)探针修饰电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
技术介绍
目前研究报道的传感器表面固定的大多是DNA探针，存在诸多缺点。探针长度一般为20个碱基左右，DNA探针与较长的靶序列杂交时，结合力不高，碱基错配识别能力低。另外，由于单链DNA无法与未解旋的双链靶序列直接结合，所以待检测的标本需经PCR扩增后才能与之反应。同时，NDM-1探针的反应受离子强度的影响，酸性或碱性环境中DNA固定数量最多，而中性条件下杂交效果最好，固定双链探针比固定单链探针时杂交效果好，分析原因可能是单链固定时会对杂交产生更大的空间障碍。众多的研究者均未能很好地解决上述问题，从而无法提高DNA探针的特异性。而LNA的出现是解决以上问题的理想途径。锁核酸是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物，含有一个或多个2'-0,4'-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体，结构中核糖的2'-0,4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，连接成环形，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构，降低了核糖体构象的可塑性，增强了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，从而形成刚性缩合结构。相比其他寡核苷酸，LNA具有诸多优势：(1)和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；(2)抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3)LNA-DNA杂交物能激活RNaseH；(4)与RNA/DNA杂交时，具有较强的碱基错配识别力；(6)水溶性好；(7)高效的自动寡聚化作用，合成方法简单。NDM-1多重耐药菌是指携带NDM-1耐药基因的细菌。NDM-1耐药酶其全称是“新德里金属-β-内酰胺酶”，是一种高效耐药酶。研究显示，抗生素滥用是NDM-1出现的首要原因，目前DM-1多重耐药菌正在全球快速传播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重耐药菌所带来的风险越来越大，防控形势极为严峻，该类细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性。NDM-1耐药基因可以在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细菌获得耐药性。因此，研发NDM-1直接快速特异的检测方法，具有重要意义。目前，NDM-1多重耐药菌的诊断主要包括筛查、表型确认和基因确证等3个步骤。表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协同实验或亚胺培南(美洛培南)/EDTA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基因确证是采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。但这些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。电化学DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、特异性强、灵敏度高、检测限低、使用简单以及成本低廉等显著优点。目前电化学生物传感器的研究主要是致力于提高传感器的特异性和灵敏度，而特异性和灵敏度在很大程度上受探针与互补链间的相互作用影响，因此，利用LNA探针提高电化学生物传感器的特异性是检测NDM-1的基因的关键。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供NDM-1锁核酸探针修饰电极；本专利技术的目的之二在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供含有检测NDM-1的电化学生物传感器；本专利技术的目的之四在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极或所述电化学传感器的应用；本专利技术的目的之五在于提供利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、NDM-1锁核酸探针修饰电极，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针，最后封闭非特异性吸附位点而得。优选的，所述5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针的溶液，修饰后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1锁核酸探针修饰电极。优选的，步骤a是将金电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙酮和超纯水中各超声洗涤，干燥，备用。优选的，步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针浓度为0.5～2.5μM的溶液，固定后用浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液封闭，清洗得NDM-1锁核酸探针修饰电极。更优选的，所述5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针的浓度为1.5μM。更优选的，5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针固定的条件为37℃下恒温1小时。3、检测NDM-1的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和为测试底液；所述工作电极为所述NDM-1锁核酸探针修饰电极，所述对电极为铂电极，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述为测试底液为pH7.4的含2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS溶液。4、所述NDM-1锁核酸探针修饰电极或所述检测NDM-1的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。5、利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，包括如下步骤：将NDM-1锁核酸探针修饰电极与样品溶液杂交后，然后以NDM-1锁核酸探针修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，pH7.4的含2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0.3V～0.7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂交前后峰电流变化检测NDM-1基因。本专利技术的有益效果在于：本研究利用锁核酸的高特异性，针对NDM-1全基因组，设计针对NDM-1基因的LNA，将NDM-1LNA探针固定在金电极后获得NDM-1锁核酸探针修饰电极，然后与电化学技术相融合获得检测NDM-1基因的电化学生物传感器，从而构建检测NDM-1基因的技术平台，为多重耐药菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异的检测工具。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为不同修饰电极的循环伏安图。a：裸电极在pH7.4含有2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS中循环伏安曲线；b：电极表面修饰LNA探针后在pH7.4含有2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS中循环伏安曲线；c：LNA探针修饰、巯基己醇封闭后的电极在pH7.4含有2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS中循环伏安曲线；d：检测液中加入NDM-1靶序列后，电极在pH7.4含有2mmol/LK3Fe(CN)6-K4Fe(CN)6和5mmol/LKCl的PBS中循环伏安曲线；e：裸电极在pH7本文档来自技高网...

【技术保护点】
NDM‑1锁核酸探针修饰的电极，其特征在于，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM‑1LNA探针，最后用巯基乙醇封闭非特异性吸附位点而得。

【技术特征摘要】
1.NDM-1锁核酸探针修饰的电极，其特征在于，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针，最后用巯基乙醇封闭非特异性吸附位点而得；所述NDM-1锁核酸探针的具体序列为：5'-SH-(CH2)6-gcttttggtggctgcctgat-3'，SH代表巯基基团，下划线部分碱基经锁核酸修饰。2.权利要求1所述NDM-1锁核酸探针修饰的电极的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针溶液，修饰完成后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1锁核酸探针修饰的电极。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤a是将金电极分别用0.3μm、0.05μm的Al2O3粉末打磨抛光，每次打磨后用超纯水洗净，再分别于硝酸、丙酮和超纯水中超声洗涤，干燥，备用。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加浓度为0.5~2.5μM的5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针溶液，修饰后用浓度为1mmol/L的巯基己醇溶液封闭，清洗得NDM-1锁核酸探针修饰的电极。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述5’端修饰巯基的N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立群，王云霞，府伟灵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85