一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条及其制备方法，包括主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备牛血清白蛋白(BSA)溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。本发明专利技术的试纸条稳定效果好，具有良好的稳定性，灵敏性和敏感性均较高，利于临床应用，利于指导临床的配种工作，能够有效地指导工作人员对疾病的诊断、治疗，提高受胎率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备牛血清白蛋白(BSA)溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。本专利技术的试纸条稳定效果好，具有良好的稳定性，灵敏性和敏感性均较高，利于临床应用，利于指导临床的配种工作，能够有效地指导工作人员对疾病的诊断、治疗，提高受胎率。【专利说明】-种奶牛乳汁孕鋼胶体金检测试纸条及其制备方法
本专利技术属于生化领域，尤其涉及一种奶牛乳汁孕丽胶体金检测试纸条及其制备方 法。
技术介绍
在实际生产中对奶牛妊娠检测普遍依靠直肠检查和B超检查，直肠检查的不确定 性和B超仪器的价格高昂成为了临床应用的弊端。孕丽是一种留体类激素，作为卵巢的指 示剂，监测奶牛体内分泌孕丽含量的变化能够有效对妊娠情况和繁殖状况进行检测，是进 行早孕检查和繁殖疾病监测的一种有效方法。 胶体金试纸条检测方法具有易学、快速、方便、成本低、无需任何仪器设备条件和 所用试剂无毒害性等优点，适合在实际生产当中的各项要求。通过检测奶牛乳汁中孕丽的 含量通过胶体金呈现出的颜色反应变化，很直观的判定出孕丽的浓度高低，判定出奶牛妊 娠情况。国外在奶牛早孕检测方面已经有很多类似的产品，并得到了很好的应用。国内对 奶牛孕丽检测的研究也有很多相关的产品如试剂盒、传感器和胶体金等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种奶牛乳汁孕丽胶体金检测试纸条的制备方法，旨在解 决在实际生产中对奶牛妊娠检测普遍依靠直肠检查和B超检查，直肠检查具有不确定性和 B超仪器的价格高昂的问题。 本专利技术是该样实现的，一种奶牛乳汁孕丽胶体金检测试纸条的制备方法的制备方 法包括： 步骤一、主要溶液的配制，包括制备巧樣酸H轴溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3 溶液、制备PBS溶液、制备BSA溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液； 步骤二、胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕丽抗 体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度 的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、 胶体金试纸条的组装。 进一步，所述的主要溶液的配制的具体方法如下： 制备巧樣酸H轴溶液：称取Ig巧樣酸H轴和IOOmL加超纯水，制备成浓度为1 % 的巧樣酸H轴溶液，现用现配； 制备氯金酸溶液；称取Ig氯金酸，和超纯水IOOmU制备成氯金酸溶液，4C保存； 制备K2CO3溶液；称取0. 1恥C〇3溶于100血超纯水，制成K2CO3溶液，现用现配； [001引 制备PBS溶液：将8. OQgNa化、0. 29巧&口04、0. 29巧化和2. 99径化2册04. 2&0混合， 加蒸觸水至1000血，将抑值调至7. 4 ; [001引制备BSA溶液；称取5g的BSA加入100血超纯水，充分溶解； 制备样品垫处理液；含 1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP，0. 5% Tween-20 和 0. 02% (w/ V)叠氮轴的 Tris(0. 05M 抑=5. 5); 制备金标复溶液：含 20% (w/v)藏糖，1% (w/v)BSA，1% (w/v)PVP 和 0. 02% (w/ V)叠氮轴的 PBS (0. Ol5M 抑=7. 4)。 进一步，胶体金的制备的具体方法为： 应用巧樣酸H轴还原法巧引制备胶体金，操作步骤；将现配的1 %氯金酸溶液 1血，稀释至100血（终浓度为0.01% )，用微波炉加热至IOOC后，迅速向其中加入1 %巧 樣酸溶液2mU揽拌均匀，继续加热3min，直至溶液由灰黑色变成酒红色时取出，继续揽拌 lOmin，冷却至室温，用去离子水或超纯水定容将所失水分补充至原体积，重复制备H到四 次，用一次性滤膜化22 y m)过滤后，4°C保存备用。 进一步，胶体金质量鉴定的具体方法为： 直观鉴定；肉眼观察胶体金的颜色变化，看有无浑浊、是否透明、有无折光性和有 无凝胶； 电镜观察；观察胶体金颗粒大小、形态和密度； 可见光谱观察；在分光光度计0D400""至0D700""光谱范围内对胶体金溶液进行扫 描，根据所得的数值判断胶体金颗粒的直径与最大吸收波长之间的关系，评价胶体金溶液 的质量； 稳定性鉴定；将胶体金溶液放置于室温、4C和37C分别存放2化，观察其凝聚情 况。 进一步，金标孕丽抗体复合物的制备与纯化的具体方法为： 单克隆抗体的除盐；标记前的单克隆抗体应彻底除盐，具体方法；将抗体溶液用 PBS溶液（pH = 7. 4) 4°C透析过夜，4°C离也Ih (15000巧m)，抽取上清去除沉淀，4°C保存备 用； 确定胶体金最适蛋白标记量：通过Mey氏稳定性实验确定胶体金最适蛋白标记 量，具体方法；取2mL离也管7个，分别编号，分别加入ImL胶体金溶液，由10 y g/mL-60 y g/ mL加入逐级稀释后的孕丽抗体蛋白溶液，其中一管为空白对照，室温稳定5分钟后，分别向 各管加入0. ImL的10%氯化轴溶液。将上述溶液摇匀后，静止化，最后观察结果； 紫外分光光度计确定最适抗体标记量；将配置溶液静置化，500化pm离也比，测定 溶液在520nm下的吸光度值；OD值为垂直纵坐标，抗体蛋白用量为水平横坐标绘制曲线； 胶体金标记抗体最适抑值的测定；胶体金溶液对抑计电极有损害，本研究中关于 胶体金溶液抑值的测定使用抑试纸，确定胶体金标记抗体的最适抑值； 胶体金标记抗体方法；称取胶体金溶液置于锥形瓶，称量100血的0. lmol/LK2C03 或0. Imol/L的肥1溶液将胶体金溶液的抑值调整至8. 6 ;加入48 y g/mL孕丽单克隆抗体 溶液48 y L逐滴加入，边加边揽拌，加完后再继续揽拌30min ;再加入5%阳G2000溶液，最 终浓度为1%，再揽拌30min; 金标抗体复合物纯化：采用离也纯化法纯化金标孕丽抗体，4°C条件下W 2, 00化/ min低速离也比，弃去沉淀；将上清液再次1500化/min高速离也比，弃上清；之后4°C条 件下18, OOOr/min离也比，反复离也两次；最后将沉淀用金标抗体稀释液稀释为原体积的 10 %，置于4C冰箱备用。 进一步，抗原包被液和金标稀释液的选择的具体方法为： 抗原包被稀释液选择： A 溶液；0. Olmol/L 的 PBS (pH = 7. 4); [003引 B溶液；0. Olmol/L的Tris-盐酸缓冲液仰巧（pH = 7. 4); C溶液；0. Olmol/L的碳酸盐缓冲液（pH = 9. 6); [00对 D溶液；0. Olmol/L的碳酸盐缓冲液（pH = 9. 0); E 溶液；0. Olmol/L 的 TBS (p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述的奶牛乳汁孕酮胶体金检测试纸条的制备方法的制作方法包括：步骤一、主要溶液的配制，包括制备柠檬酸三钠溶液、制备氯金酸溶液、制备K2CO3溶液、制备PBS溶液、制备BSA溶液、制备样品垫处理液、制备金标复溶液；步骤二、胶体金的制备与鉴定，包括胶体金的制备、胶体金质量鉴定、金标孕酮抗体复合物的制备与纯化、抗原包被液和金标稀释液的选择、金标抗体稀释液选择和稀释度的选择、NC膜的选择和二抗包被浓度选择、NC膜封闭液和封闭时间的选择、样品垫的选择、胶体金试纸条的组装。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：夏成，吴凌，徐闯，郑家三，包凯，孙雨航，李颖，许楚楚，张洪友，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23