人血管钠肽与人血清蛋白的融合蛋白及其制备制造技术

人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠PCR技术，将hVNP和HSA cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主表达系统中进行表达。本发明专利技术的融合蛋白包括与人血管钠肽至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人血管钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法，属于长效重组融合蛋白药物
。本专利技术利用重叠PCR技术，将hVNP和HSA cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主表达系统中进行表达。本专利技术的融合蛋白包括与人血管钠肽至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本专利技术的融合蛋白在保持了人血管钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。【专利说明】人血管钠肽与人血清蛋白的融合蛋白及其制备
本专利技术属于长效融合蛋白药物
，涉及一种人血管钠肽(hVNP)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
心脑血管疾病的高发病、高死亡率已经成为世界共识，心力衰竭(heart failure,HF)则是大多数器质性心脏病人心脏病病程的严重阶段。重组B-型利尿钠肽(B-typenatriuretic peptide, BNP)已经成为HF的常规治疗药物,但BNP是一种有效的血管扩张齐U，其利尿作用尚存在疑问，同时在高剂量下，容易出现低血压症状。血管钠肽(vasonatrinpeptide, VNP)是wei等在深入研究人钠尿肽家族各个成员的结构与生物学活性关系基础之上，在人CNP分子的C-末端加上ANP的C-末端的5个氨基酸残基，设计出的具有新型生物活性的嵌合体，在扩张动脉、静脉血管和排钠利尿方面均有显著疗效。已有研究表明，在治疗慢性心力衰竭、高血压等疾病中，与天然钠尿肽相比VNP更具有应用前景。 像临床上已广泛使用的其它重组多肽/蛋白类药物一样，重组VNP药物溶解度低、稳定性差、体内半衰期仅为3min，必须持续高剂量给药方能奏效。该类药物治疗费用高、药物利用度低，患者频繁注射，导致其实际用量远地低于需求量。提示有必要重视长效VNP药物的研发，满足临床应用的需要。 人血清蛋白(HSA)作为人体血浆的主要成分在体内具有无酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期长(大约23天)等优点。以HSA为载体的融合蛋白技术(Albumin Fus1nTechnology)受到重视。将HSA基因和人干扰素a 2b (IFNa 2b)基因融合，表达的融合蛋白HSA-1FN a 2b在体内的平均半衰期达140h，且有很好的抗病毒活性、安全性和耐受性。这种融合蛋白质一方面增加了药物分子量，降低了肾脏的排泄速率；另一方面，融合的蛋白分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对普通IFNa 2b的水解作用，从而有效地延长了蛋白分子药物在循环系统内的滁留时间。通过改变药物的药代动力学特性，使得药物的血浆浓度更加稳定，药物在体内维持的时间更长，从而达到提高药物疗效和降低副作用的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法。 本专利技术所述人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的第一种方案为:包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽至少85%序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少85 %序列同源或为人血清白蛋白的部分氨基酸序列；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。 优选地，所述第一区与人血管钠肽至少95%序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少95%序列同源。 优选地，所述人血清白蛋白的部分氨基酸序列为人血清白蛋白部分结构域或经结构域重排后的人血清白蛋白；具体地，其除了包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述:名为HSA(1-η)，η为369-419。 本专利技术所述人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的第二种方案为:包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽氨基酸残基序列相同或为其功能等同物，所述第二区与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同或为其功能等同物；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。 所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。 本专利技术还提供了一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，包括步骤: I)人工合成人血管钠肽hVNP cDNA ； 2)通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA ； 3)利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA,中间不加入任何连接肽，得到的hVNP-HSA cDNA融合基因； 4)将hVNP-HSA cDNA融合基因通过表达载体整合到宿主细胞的染色体中，在宿主细胞中进行表达。 进一步地，步骤3)获得的hVNP-HSA cDNA融合基因可插入到克隆载体中保存，优选的克隆载体为pBlu2KSP。 步骤4)中所述的宿主细胞可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞等，优选的宿主细胞是酵母，其中更优选的是毕赤酵母，最优选为毕赤酵母GS115。 优选地，步骤4)中所述表达载体选自:pPIC9、pPIC9K、pHIL-Sl、pPICZ α、pYAM75P6、pPIC3K、pPICZ、pHW010、pGAPZ和pGAPZ α中的一种，最优选为毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K。 优选地，步骤4)中所述整合到宿主细胞的染色体中的方法为转化锂盐法、PEG法、原生质体法或电穿孔法。 由于hVNP基因较短，采用人工合成该基因。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。利用重叠PCR技术，连接hVNP cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，以避免因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫原性方面的问题，得到的hVNP cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。 hVNP cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个宿主系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本专利技术优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。更优选的是毕氏酵母表达系统，和酿酒酵母表达系统相比，毕氏酵母表达系统在蛋白分泌和糖基化方面具有明显的优势。毕氏酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于纯化；糖基化程度低，避免了酿酒酵母超糖基化带来的免疫源性问题。 毕氏酵母表达系统分泌型表达载体主要有pPIC9，pPIC9K，pHIL-Sl，pPICZ α，ΡΥΑΜ75Ρ6 ;胞内型表达载体主要有:pPIC3K，pPICZ, pHWOlO, pGAPZ, pGAPZ a (invitrogen)等，优选的是毕赤酵母分泌型表达载体PPIC9K，它是酵母整本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人血管钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于：包括第一区和第二区，所述第一区与人血管钠肽至少85％序列同源，所述第二区与人血清白蛋白至少85％序列同源或为人血清白蛋白的部分氨基酸序列；所述第一区位于融合蛋白的N末端，所述第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述第二区位于融合蛋白的N末端，所述第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张雁云，金坚，钱柳，金敏，王慧，姜曰水，崔燕生，陈蕴，刘强，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31