一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本发明专利技术所提供的dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。实验证明，饲喂谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA后，麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率均比对照显著降低。这表明谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明专利技术为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及在防治麦长管蚜中的应用
本专利技术属于生物
，涉及一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。
技术介绍
小麦是我国的主要粮食作物。小麦田内害虫种类很多，主要害虫有地下害虫、小麦吸浆虫、麦蚜、麦蜘蛛、食叶的粘虫等,其中麦蚜对小麦的危害最为严重。麦蚜属同翅目蚜科，俗称腻虫、由汗、蜜虫等，是我国小麦上的主要害虫之一。其种类主要包括麦长管蚜(Sitobionavenae)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、禾谷缢管蚜(RhopalosiphumpadiLinnaeus)、麦无网长管蚜(Acyrthosiphondirhodum)等。麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜在世界各个地区广泛分布，我国小麦种植区内均有发生。麦二叉蚜主要分布在西北、华北地区，麦长管蚜危害南北麦区，禾谷缢管蚜在南方地区发生严重。麦蚜的发生受气候影响较大，在小麦生不同的生长期内，麦蚜的危害优势种有所不同，在小麦拔节期，麦二叉蚜种群密度大，到达抽穗期，麦长管蚜逐渐变为优势种，麦二叉蚜与麦长管蚜混合发生，小麦抽穗以后，禾谷缢管蚜发生严重。麦蚜以若蚜、成蚜聚集在小麦叶片、茎干，吸食小麦汁液，造成小麦叶片出现黄斑或枯萎，在苗期危害严重时造成小麦苗枯死，后期危害穗部，造成小麦籽粒干瘪，使小麦品质变劣，产量降低。麦蚜排出的废物覆盖在叶片上使叶片变黑，光合作用受到严重影响。此外，麦蚜还分泌毒素，传播病害，严重影响小麦产量和品质。因麦蚜的危害造成小麦减产一般在10％-20％，麦蚜危害严重时小麦减产量达到30％。麦蚜还可以传播小麦与大麦黄矮病毒，使小麦产量降低。RNAi的基本过程包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA穿过细胞膜进入细胞后，细胞质中的一种RNA酶Ⅲ家族的内切酶Dicer酶特异识别dsRNA，Dicer酶将dsRNA切割成许多21bp-23bp的小片段(smallinterferenceRNA，siRNA)，每个siRNA都有2个突出的核苷酸。效应阶段，siRNA与一个酶复合物形成一种沉默复合物(RNA-indueedsileneeingeomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，携带的双链siRNA被RISC变成单链siRNA分子，变成具有活性的RISC(Slicer)。之后Slicer与外源性基因表达的mRNA分子结合，RISC在结合部位开始切割mRNA。切割后的mRNA诱导细胞降解这些mRNA片段。siRNA还能引导目的RNA结合RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)，合成新的dsRNA，然后由Dicer酶切割产生新的siRNA，又引发新一轮的合成切割过程，沉默信号逐渐扩大。目前常用的dsRNA导入的方法有注射法、浸泡法、饲喂法、组织培养法、植物介导法等。注射法是通过显微注射仪将dsRNA导入到昆虫体内，是目前最常用的方法。这种方法既有优点又有缺点，优点是效率高，缺点是体外合成保存dsRNA成本高，难以避免注射的伤口影响昆虫生长。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆虫组织或细胞，可以有效地抑制基因表达。浸泡法有一定的局限性，只适合于昆虫一定的发育阶段和易吸收dsRNA的细胞组织，在研究中应用较少。饲喂法操作方便且简单，对昆虫的影响小。喂食dsRNA在许多昆虫中都取得了成功，例如半翅目、鳞翅目、鞘翅目昆虫。组织培养法将dsRNA混入培养基，昆虫细胞从培养基里吸收dsRNA。目前利用这种方法取得成功的昆虫有果蝇、埃及伊蚊、白纹伊蚊。这种方法要求的培养基条件严格，不容易培养得到符合要求的细胞，对这种方法的使用受一定限制。转基因植物介导法是借助植物持续不断的产生稳定的dsRNA，昆虫持续取食这种植物会不断的摄入dsRNA。但是这种方法也有一定的局限性，不同昆虫或同一昆虫的不同基因对通过口腔进入的RNAi的敏感性不同，影响喂食dsRNA的成功率的关键因素是昆虫的上皮细胞摄入dsRNA的效率。Walshe等发现利用喂食方法可以抑制刺舌蝇(Glossinamorsitansmorsitans)中肠表达TsetseEP，却不能抑制脂肪体的传递蛋白基因2A192的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种谷胱甘肽-S-转移酶基因(GST基因)dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本专利技术所提供的dsRNA，具体为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。编码所述dsRNA的DNA分子也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系也属于本专利技术的保护范围。所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系，在如下(a1)-(a5)任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；(a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；(a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；(a5)抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达或制备抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达的产品。进一步，所述应用为将所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降低麦长管蚜存活率、抑制麦长管蚜生长、降低麦长管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达。在本专利技术中，所述导入的方式具体为饲喂。更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度具体为5-20ng/μL(如20ng/μL)。所述饲喂持续的时间可为5天以上，具体如5-6天。在本专利技术中，所述麦长管蚜具体为若虫期麦长管蚜，具体如2龄麦长管蚜。活性成分为如下A-C中任一种的产品也属于本专利技术的保护范围：A、所述dsRNA；B、所述DNA分子；C、所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系；所述产品具有如下(a1)-(a5)功能中的至少一种：(a1)防治麦长管蚜；(a2)降低麦长管蚜存活率；(a3)抑制麦长管蚜生长；(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数；(a5)抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达。另外，抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达的物质，在如下(a1)-(a4)任一中的应用同样属于本专利技术的保护范围：(a1)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；(a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；(a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；(a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品。本专利技术将麦长管蚜GST基因dsRNA(序列1)采用体外饲喂的方法饲喂麦长管蚜，实际上是利用RNAi技术对GST基因的表达进行干扰。结果显示，从mRNA水平上检测饲喂后的麦长管蚜GST基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂GST基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率均比对照降低。这表明GST本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。

【技术特征摘要】
1.一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。2.权利要求1所述的dsRNA在防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品中的应用。3.权利要求1所述的dsRNA在如下（a1）-（a4）任一中的应用：（a1）降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；（a2）抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；（a3）降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；（a4）抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达或制备抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达的产品。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁荣奇，赵章武，邓菲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11