本发明专利技术涉及水稻转录因子Os02g49250基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os02g49250基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒长度、宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及水稻转录因子0s02g49250基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子0s02g49250基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒长度、宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。【专利说明】水稻转录因子0s02g49250基因的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s02g49250基因的应 用。
技术介绍
水稻（Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。 近些年，有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，如：研 究者们利用QTL定位了一些籽粒大小相关基因，其中GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和器 官大小的负调控因子；张启发等研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是 控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒大 小方面起着非常重要的作用，0sWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，0sWRKY78突 变体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)类转录因子能通过调控 外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小；PGLl碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)异源二聚 体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。 VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转 录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转 录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出 现更明显的表型变化。 Homeoboxes (同源结构域蛋白）HB家族转录因子在动物界首先在果蝇中，植物在 拟南芥中首次被发现。HB家族有300多个成员，参与了生物的生长发育多个方面。从结构 上分析，Homeoboxes拥有DNA识别位点，包括TATA等一系列和DNA结合的结构域。目前HB 家族转录因子0s02g49250对种子大小形状调控机制的研究及认识很少，因此该转录因子 的研究在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供了新的线索；在实 践上也将为作物高产育种提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻转录因子0s02g49250基因的应用。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为 (VP16) 4-Linker-0s02g49250 ； 其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQ ID No. 9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；0s02g49250为水稻转 录因子 0s02g49250。 所述水稻转录因子0s02g49250的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 其中，（VP16) 4 即 VP64,是由 4个 VP16 功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)以Gly Ser两个氨基酸间隔融合在一起组成的增强子，其序列如SEQ ID No. 10所示，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。 本专利技术还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷 酸序列杂交的核苷酸序列 ；其中，所述严格条件为65°C，在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS 的溶液中杂交并洗膜。 本专利技术还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。 所述载体的构建方法如下： (1)在植物转录因子数据库中找到0s02g49250基因，根据其序列设计PCR扩增引 物对，其为正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAGGAGAAGGAGGAGA-3' 和反向引物 R : 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGACCGACATGAACGCGAAATC-3，； (2)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s02g49250全序列； (3)将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列； (4)以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64_Gateway 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35S promoter-hyg 表 达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示； (5)通过LR反应将0s02g49250构建到其目地基因的N端融合了 VP64标签的植 物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得载体ubi :VP64-0s02g49250,载体全序列如SEQ ID No. 6所示。 携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 页； Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。 本专利技术还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。 本专利技术还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法， 将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。 本专利技术还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状(如增加水稻粒长、 粒宽及千粒重）中的应用。 本专利技术还提供了用于扩增水稻转录因子0s02g49250基因的引物对，其为 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGAC CGACATGAACGCGAAATC-3,。 本专利技术还进一步本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为（VP16）4‑Linker‑Os02g49250；其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；Os02g49250为水稻转录因子Os02g49250。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵涛，张春雨，刘斌，李宏宇，刘军，林辰涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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