一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法，包括步骤a.选用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL（DE3）CGMCC No.4953做为菌株进行发酵培养，还包括步骤：b.对发酵培养所得菌体进行洗涤、破碎；c.对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理；d.对硫酸铵沉淀处理所得菌体物质进行层析纯化处理；e.对层析纯化所得菌体物质进行脱盐和缓冲液更换处理。同现有技术相比较，采用本制备方法，可以实现TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，提供了，包括步骤a.选用工程菌LZ-TRAIL95-pET25b-BL(DE3)CGMCCNo.4953做为菌株进行发酵培养，还包括步骤：b.对发酵培养所得菌体进行洗涤、破碎对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理；d.对硫酸铵沉淀处理所得菌体物质进行层析纯化处理对层析纯化所得菌体物质进行脱盐和缓冲液更换处理。同现有技术相比较，采用本制备方法，可以实现TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。【专利说明】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备 方法。
技术介绍
1995年，Wiley SR等报道从人表达标签序列文库（EST, expressed sequence tag) 中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体 (tumor necrosis factor-relate d apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素 2 配体（Apo2L)，属于肿瘤坏死因子超家族（Wiley SR, et al.，Immunity3:673-682, 1995)。人 TRAIL基因位于染色体3q26,全长1769bp，共编码281个氨基酸。TRAIL蛋白是一种II型跨 膜蛋白，分子量为32. 5KDa，理论等电点为7. 63,其中C末端114-281位氨基酸构成了 TRAIL 蛋白的胞外区，发挥主要功能。 研究表明，TRAIL对多种恶性肿瘤具有抑制细胞生长和细胞毒作用， 而人体的正常细胞则对TRAIL诱导的凋亡耐受（Ashkenazi A, et al.，J Clin InvestKM: 155-162, 1999)。鉴于TRAIL蛋白在抗肿瘤领域的潜在临床应用价值，TRAIL作 为抗肿瘤药物的开发受到了越来越多的关注。 TRAIL虽然在体内外实验以及临床实验中均显示了显著的抑制肿瘤细胞生长的作 用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有40分钟，严重影响了 TRAIL蛋白在体内的疗效。 本专利技术的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白，其包含：人源亮氨酸拉链结 构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。与野生型 的TRAIL相比，TRAIL融合蛋白的稳定性显著增加，半衰期大幅延长，治疗效果显著提高，具 有广泛的应用前景。 目前，TRAIL蛋白的表达主要采用酵母和大肠杆菌两种表达系统。酵母表达系统 成本较高且容易造成TRAIL蛋白的基团修饰；大肠杆菌表达系统表达的TRAIL蛋白大多为 包涵体，可溶性蛋白产量低，并且纯化过程繁琐复杂。因此，开发适用于规模化生产的TRAIL 蛋白制备工艺，对TRAIL蛋白的临床应用意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在大肠杆菌中表达的TRAIL融合蛋白的制备方法，此种 制备方法实现了 TRAIL融合蛋白的工业化生产，为TRAIL融合蛋白的实际应用提供可能。 本专利技术提供的TRAIL融合蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤的层析纯化 处理： 1)发酵上清液，上亲和层析柱，收集37. 5mmol/l咪唑洗脱目的峰； 2)上阴离子交换层析柱，收集40%盐浓度目的峰； 3)上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰； 4)上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰。 本专利技术所述的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白包括：人源亮氨酸拉链结 构域；人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。 TRAIL (肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）是一种在本
内被熟知的蛋 白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体 DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源 TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281 位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No:7所示. 依照本专利技术，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：（1)人源亮氨酸拉 链序列；（2)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；（3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL 蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受 体 DR5 (TRAIL-RII)相结合。 融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足 以与死亡受体DR4 (TRAIL-RI)和死亡受体DR5 (TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的 TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片 段。 更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含 TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一 种实施方案中，本专利技术所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID No:2所示氨基酸 序列。 作为优选，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdxl 或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。 在本专利技术的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID No: 1 所示的氨基酸序列。 在一种实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID No:3所示的氨基酸序 列。 在本专利技术的实施例中，具体提供一种重组了编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分 子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4953。 本专利技术的层析纯化步骤1)中所述亲和层析柱介质为Ni-NTA ;步骤2)中阴离子交 换柱介质为Q Sepharose Fast Flow;步骤3)中疏水层析柱介质为Butyl Sepharose4FF; 步骤4)中疏水层析柱介质为Phenyl Sepharose High Performance。 本专利技术的层析纯化中的发酵上清液通过以下步骤获得： ①选用工程菌 LZ-TRAIL95-pET25b-BL21 (DE3) CGMCC No. 4953 作为菌株进行发酵 培养； ②对发酵培养所得菌体进行洗涤和破碎； ③对破碎所得菌体物质进行硫酸铵沉淀处理。 本专利技术对于工程菌发酵培养所得的菌体进行洗涤和破碎，具体步骤包括：在发酵 所得菌体中加入含有DTT和溶菌酶的Tris-Cl溶液；使用高速剪切机和高压均质机破碎菌 体；经离心后分离获得上清。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇，分子式为 C4HltlO2S2，分子量为 154. 25。 发酵上清液经过层析纯化步骤之后，还需要对层析处理所得菌体物质进行脱盐和 缓冲液更换处理，具体步骤： ①向层析纯化后蛋白溶液中加入柠檬本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤的层析纯化处理：1）发酵上清液，上亲和层析柱，收集37.5mmol/l咪唑洗脱目的峰；2）上阴离子交换层析柱，收集40%盐浓度目的峰；3）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰；4）上疏水层析柱，收集55%盐浓度目的峰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏云鹏，刘晓斌，周宇，王猛，邓磊修，
申请(专利权)人：江苏先声药物研究有限公司，江苏先声药业有限公司，山东先声麦得津生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32