重组人白介素15长肽段及其生产方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人白介素15长肽段及其生产方法，所述生产方法为：获得人IL-15长肽段基因；构建真核表达载体并将其转化到毕氏酵母X-33中；抗性筛选高水平分泌表达的酵母转化子；诱导表达，并将上清液经镍柱及离子交换柱纯化，得rhIL-15L。本发明专利技术所述生产方法将载体pPICZαA上Kex2P1’位点氨基酸残基Ala突变为Pro，并以毕氏酵母X-33为宿主菌，实现了rhIL-15L的大量高效稳定表达；该方法制得的重组蛋白rhIL-15L带有HIS及C-MYC标签，易于蛋白纯化和检测，且其是经一定程度糖基化修饰的糖蛋白，具有良好的生物活性，可有效维持体外和小鼠体内人源NK细胞的增殖及生物活性。

【技术实现步骤摘要】
重组人白介素15长肽段及其生产方法
本专利技术涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物
，特别是涉及一种高效重组人白介素15长肽段(rhIL-15L)及其生产方法。
技术介绍
白介素15(又称IL-15)，作为一种T细胞生长因子最早于1994年被发现。与白介素2、白介素4、白介素7、白介素9、粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子类似同属于4a螺旋细胞因子家族。白介素15组成型表达于包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、神经细胞等在内的多种类型细胞。人源IL-15基因由9个外显子和8个内含子组成，5到8号外显子编码长度为162个氨基酸的成熟白介素15，白介素15的受体是由a、β、γc组成的异源三聚体，其氨基酸一级结构参见图1a。作为一种多效细胞因子其在先天性免疫和获得性免疫反应中起着重要的作用，IL-15的主要功能是调节T细胞和NK细胞的活化与增殖，其次IL-15也参与NK细胞的发育与成熟。炎症与肿瘤的发生密切相连已成为一种共识，由于IL-15可促进NK细胞、B淋巴细胞及T淋巴细胞的增殖并可维持这些免疫细胞功能，因此IL-15对于治疗一些恶性肿瘤存在一定疗效。在很多肿瘤老鼠模型的临床研究中研究者发现IL-15具有抗肿瘤的作用，一项最新的研究结果表明，IL-15可延长代谢性CT26结肠癌小鼠的寿命。非血液性肿瘤中，IL-15几乎不直接参与实体瘤的形成，但一定程度上IL-15通过免疫监视可间接抑制肿瘤的形成。一项研究发现在40位不同实体瘤患者血清中IL-15的水平并无显著性差异且均呈正常水平。事实上，IL-15可能通过某种保护作用抑制肿瘤的发育。众所周知，随着年龄增长癌症发病率随之上升，在一项老鼠的研究中发现随着年龄的增长血清中的IL-15呈下降趋势。IL-15可增强随年龄增大逐渐下降的免疫监视能力，通过这种方式可为机体提供一种保护机制防止肿瘤的发生。在肿瘤和感染疾病模型的临床研究中发现IL-15是一种有效的疫苗佐剂。Steel和他的同事开发了一种靶向性治疗neu+乳腺癌的DC疫苗，这种DC疫苗可组成型表达IL-15。同时免疫IL-15表达型DC细胞和Neu的动物比单独免疫Neu的动物乳腺癌复发时间明显延长。IL-15Ra/IL-15共表达改进型DC疫苗效果比上述效果更为明显。这项研究同时表明IL-15可克服CD4辅助细胞缺陷增强抗肿瘤抗体的免疫应答。研究表明IL-15通过抑制TRAIL介导的细胞凋亡能克服CD4辅助细胞缺陷允许CD8+免疫应答。研究人员现正将IL-15作为一种刺激体内免疫细胞活性的免疫佐剂进行评估，现阶段已有的临床结果表明培养基中添加IL-15培养出的NK，CD8+T细胞，CD8+记忆T细胞及树突状细胞转移至动物体内后生物活性显著提高。随着对IL-15作用机制及临床应用研究的不断深入，IL-15作为药物及免疫佐剂其需求量也大大增加。目前，市场上主要利用原核表达系统(主要是大肠杆菌)对其进行表达，目前还没有利用毕氏酵母成功表达并纯化到IL-15的报道。大肠杆菌的表达产物通常以包涵体形式存在，需通过变性复性等一系列复杂操作才能得到活性形式的IL-15，此方法极大的限制了活性蛋白的产率；此外，原核宿主表达尤其是在大肠杆菌中表达，因为LPS的存在而产生毒素性，往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定；最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，在此过程中蛋白的产率下降，生物活性也会随之降低。虽然昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统也能表达人重组白介素15，但其生产成本高昂且产率很低。因此，目前市场上的rhIL-15价格异常昂贵。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种高效稳定生产重组人白介素15长肽段的方法，根据该方法可稳定高水平分泌表达rhIL-15L，且其是经不同糖基化修饰的rhIL-15L糖蛋白，还具有很好的生物学活性。解决上述技术问题的具体技术方案如下：一种重组人白介素15长肽段的表达纯化方法，包括如下步骤：(1)获得碱基序列如SEQIDNO.1所述的人IL-15L基因，连接到pMD-20T载体，得质粒rhIL-15L/pMD-20T，经测序确定为正确的表达序列；(2)构建并筛选真核表达载体：将pPICZαA原始载体和质粒rhIL-15L/pMD-20T分别进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL-15L，将所述重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL-15L的Kex2P’1位点Ala突变为Pro，得到重组表达载体pPICZαA/Pro/rhIL-15L；(3)转化重组载体至真核酵母宿主中：将重组载体pPICZαA/Pro/rhIL-15L用SacⅠ单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中；经过zeocin筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：将阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性转化子，再用BMGY培养基培养，甲醇诱导，得高水平分泌表达酵母转化子；(5)纯化：用镍亲和层析柱和DEAE柱对rhIL-15L进行纯化，得重组蛋白rhIL-15L。在其中一些实施例中，步骤(4)所述高水平分泌表达酵母转化子的筛选的具体方法为：将阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节细胞液中甲醇的浓度为0.95-1.05％，诱导70-74h，得高水平分泌表达酵母转化子。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的zeocin浓度梯度筛选的具体方法为：将阳性克隆转接至含有500μg/mlzeocin的YPDZ平板中，筛选到500μg/ml浓度zeocin抗性的转化子，再将所述转化子用新鲜的YPD液体培养基洗下，经稀释后涂布到1500μg/mlzeocin的YPDZ平板，以此类推直至筛选到3000μg/mlzeocin浓度的高抗性转化子。在其中一些实施例中，步骤(4)所述的诱导的时间为72h。在其中一些实施例中，步骤(5)所述的纯化的具体方法为：将高水平分泌表达酵母转化子进行扩大培养，将上清液经缓冲液A透析，再利用镍亲和层析柱于AKTA-HPLC系统中纯化，再用缓冲液A漂洗后，利用缓冲液B梯度洗脱收集mAu>100的洗脱液，将所述洗脱液利用缓冲液C透析，再利用DEAE柱于AKTA系统中纯化，0-1MNaCl、20mMTrispH8.0线性洗脱，收集mAu>50的洗脱液，即可；所述缓冲液A为：0.2M、50mM咪唑、20mMTris-HClPH8.0，所述缓冲液B为：0.2M、0.5M咪唑、20mMTris-HClPH8.0，所述缓冲液C为：20mMTris、pH8.0。在其中一些实施例中，步骤(1)为：获得碱基序列如SEQIDNO.1所述的人IL-15L基因，以所述基因为模板，用特异引物扩增hIL-15L基因片段，回收PCR产物连接到pMD-20T载体，得质粒rhIL-15L/pMD-20T，经测序确定为正确的表达序列。在其中一些实施例中，步骤(1)所述的特异引物为：IL-15Lfor：5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人白介素15长肽段的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得碱基序列如SEQ ID NO.1所示的人IL‑15L基因，连接到pMD‑20T载体，得质粒rhIL‑15L/pMD‑20T；(2)构建并筛选真核表达载体：将pPICZαA原始载体和质粒rhIL‑15L/pMD‑20T分别进行EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL‑15L，将所述重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL‑15L上Kex2P’1位点Ala突变为Pro，得到重组表达载体pPICZαA/Pro/rhIL‑15L；(3)转化重组载体至真核酵母宿主中：将重组载体pPICZαA/Pro/rhIL‑15L用Sac Ⅰ单酶切线性化，再转入毕氏酵母X‑33宿主中；经过含zeocin的YPDZ平板筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：将阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性转化子，再用BMGY培养基培养，甲醇诱导，得高水平分泌表达酵母转化子；(5)纯化：用镍亲和层析柱和DEAE柱对rhIL‑15L进行纯化，得重组蛋白rhIL‑15L。...

【技术特征摘要】
1.一种重组人白介素15长肽段的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获得碱基序列如SEQIDNO.1所示的人IL-15L基因，连接到pMD-20T载体，得质粒rhIL-15L/pMD-20T；(2)构建并筛选真核表达载体：将pPICZαA原始载体和质粒rhIL-15L/pMD-20T分别进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL-15L，将所述重组表达载体pPICZαA/Ala/rhIL-15L上Kex2P’1位点Ala突变为Pro，得到重组表达载体pPICZαA/Pro/rhIL-15L；(3)转化重组载体至真核酵母宿主中：将重组载体pPICZαA/Pro/rhIL-15L用SacⅠ单酶切线性化，再转入毕氏酵母X-33宿主中；经过含zeocin的YPDZ平板筛选得到阳性克隆；(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：将阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性转化子，再用BMGY培养基培养，甲醇诱导，得高水平分泌表达酵母转化子；(5)纯化：用镍亲和层析柱和DEAE柱对rhIL-15L进行纯化，得重组蛋白rhIL-15L。2.根据权利要求1所述的重组人白介素15长肽段的生产方法，其特征在于，步骤(4)所述高水平分泌表达酵母转化子的筛选的具体方法为：将阳性克隆转接至含zeocin的YPDZ平板中，利用zeocin浓度梯度筛选得到高抗性转化子，再用BMGY培养基培养，离心收集细胞，BMMY培养基重悬细胞，得细胞液，并调节细胞液中甲醇终浓度为0.95-1.05％，诱导70-74h，得高水平分泌表达酵母转化子。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴东海，孙伟，赖允鑫，李洪波，唐小凤，李鹏，刘鹏涛，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44