本发明专利技术提供了一种SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒。本发明专利技术通过真核表达获得SLO蛋白，还利用该蛋白发明专利技术了一种检测ASO含量的试剂盒，所述试剂盒由R1试剂、R2试剂和校准品三部分组成，其中R1试剂为磷酸盐缓冲体系，R2试剂为胶乳悬浮液，校准品主要为牛血清基质。本发明专利技术采用真核表达系统表达出纯度高、活性强的，并且采用复合乳胶颗粒包被SLO蛋白抗原，解决了目前市场上ASO检测灵敏度不高、重复性欠佳、不能满足临床对ASO定量的要求的问题，明显提高了测定结果的灵敏度、准确性和线性。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种SL0蛋白的真核表达和含真核表达SL0蛋白的试剂盒。本专利技术通过真核表达获得SL0蛋白，还利用该蛋白专利技术了一种检测AS0含量的试剂盒，所述试剂盒由R1试剂、R2试剂和校准品三部分组成，其中R1试剂为磷酸盐缓冲体系，R2试剂为胶乳悬浮液，校准品主要为牛血清基质。本专利技术采用真核表达系统表达出纯度高、活性强的，并且采用复合乳胶颗粒包被SL0蛋白抗原，解决了目前市场上AS0检测灵敏度不高、重复性欠佳、不能满足临床对AS0定量的要求的问题，明显提高了测定结果的灵敏度、准确性和线性。【专利说明】SLO蛋白的真核表达和含真核表达SLO蛋白的试剂盒
本专利技术属医学免疫体外诊断领域，具体涉及SL0蛋白的真核表达及应用，特别是 一种SL0蛋白的真核表达和含真核表达SL0蛋白的试剂盒。
技术介绍
SL0(链球菌血溶素0)是A组链球菌的代谢产物之一，它可以引起人红细胞的溶 解，具有很强的抗原性。人受溶血性链球菌感染后2-3周，体内便产生抗链球菌溶血素0的 抗体，即抗链球菌溶血素〇(ASO)。 A组链球菌可导致各种感染，这些感染可导致心脏与肾脏损害。通过早期诊断、有 效治疗，和对患者的检测，可降低这些风险。AS0测定对于诊断A族链球菌感染很有价值，其 存在及含量可反映感染的严重程度。A组链球菌感染后1周，AS0即开始升高，4?6周可达 高峰，并能持续数月，当感染减退时，AS0值下降并在6个月内回到正常值，如果AS0滴度不 下降，暗示可能存在复发性感染或慢性感染。多次测定，抗体效价逐渐升高对诊断有重要意 义，抗体效价逐渐下降，说明病情缓解。风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性 扁桃体炎等AS0明显升高。少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使AS0 增高。由于人们常与A族链球菌接触，正常人也存在低效价的抗体，通常，当效价>200U/ml 时，才被认为有诊断价值。少于15-20%的健康人血清中的AS0含量高于200U/ml。大多数 新生儿的AS0含量高于其母亲，但在其出生后数周内AS0含量会急剧下降。学龄前儿童的 AS0值通常低于100U/ml，然后随年龄的增加AS0值增加，并在学龄期达到顶峰，成年后AS0 值下降。除了急性阶段外，类风湿关节炎患者的血清中通常检测不到AS0值的升高。在肾 病综合征和抗体缺乏综合征患者的血清中仅有极低含量的AS0。 AS0检测原理为：以独特技术将抗原（链球菌溶血素"0"）包被在细微胶乳粒子 的表面，此包被了抗原的胶乳粒子与检测标本血清中的AS0相遇，形成抗原-抗体复合物， 产生浊度变化。且经胶乳颗粒的参与而增强浊度变化，从而可以敏感的定量检测低浓度的 AS0。通过测定600nm波长吸光度，并与校准曲线比较，求出标本中AS0的含量。 目前国内检测AS0普遍采用乳胶凝集法，该方法虽然操作简便，但其重复性、稳定 性等较差，灵敏度不高，尤其只能进行定性结果分析，不能满足临床对AS0定量的要求。原 因是国内AS0检测试剂所用抗原存在纯度不高、批间差大等问题，而且主要抗原来源主要 依靠进口，价格昂贵。本专利技术采用复合粒径胶乳颗粒增强免疫比浊法检测血清中的AS0含 量。采用自主制备的纯度高、活性强的SL0蛋白，并且采用复合胶乳颗粒包被抗原，使得本 专利技术的方法灵敏度能够检测到30U/ml提高，线性达到600U/ml。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种SL0蛋白的真核表达和含真核 表达SL0蛋白的试剂盒。本专利技术提供一种真核表达SL0蛋白的方法，同时利用该方法该方 法制备的SL0蛋白，专利技术了一种复合粒径乳胶粒子包被抗原的测试试剂盒，该试剂盒用于 检测血清中的ASO含量，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速、测定结果准确可靠的 目的。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 第一方面，本专利技术涉及一种利用甲醇酵母系统真核表达SL0蛋白的方法，具体包 括如下步骤： (1)采用真核表达系统，将SL0基因克隆于表达载体的多克隆位点，得到重组载 体；所述真核表达系统为高保真的甲醇酵母菌（Pichia Pastoris)表达系统（Lei J，Guan B，Li B，et al. Expression, purification and characterization of recombinant human interleukin-2-serum albumin(rhIL-2-HSA)fusion protein in Pichia pastoris)； (2)重组载体转化到宿主细胞大量扩增后提取重组质粒；所述宿主细胞为大肠杆 菌感受态细胞； (3)重组质粒线性化；所述线性化是由Sail进行限制性酶切； (4)接着用电击转化法将线性化的质粒载体转入酵母菌； (5)酵母菌先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度后，以甲醇为唯一碳源诱导 表达外源SL0蛋白。 优选地，所述步骤（1)中，表达载体包括pPIC9K、pDBLeu、pEXP-AD502或pPC-86中 的一种。 第二方面，本专利技术涉及一种含真核表达SL0蛋白的试剂盒，包含R1试剂、R2试剂 及校准品，所述R1试剂为磷酸盐缓冲体系，所述R2试剂为交联了 SL0抗原的致敏乳胶悬浮 液，所述校准品包括4支AS0浓度不同、溶质含量均相同的牛血清基质。 优选地，所述磷酸盐缓冲体系中，溶剂是pH7. 0?7. 6、30?80mmol/L磷酸盐缓冲 液，溶质及其在所述磷酸盐缓冲体系中的含量为：聚乙二醇200-1000060?120mmol/L，乙 二胺四乙酸二钠10?20mmol/L。 优选地，所述交联了 SL0抗原的致敏乳胶悬浮液，溶剂为pH7.0?7.6、40? 100mm〇l/L的磷酸盐缓冲液，悬浮颗粒及溶质在所述悬浮液中的含量为：复合SL0致敏颗粒 0· 1?1%，乙二胺四乙酸二钠5?25mmol/L，脱脂奶粉0.05?l%，NaN30.2?L5%。 优选地，所述复合SL0致敏颗粒的制备为：含有SL0蛋白的20mmol/L、pH7. 4的磷 酸缓冲液和聚苯乙烯胶乳以30 :100的质量比混合，37°C吸附8小时，透析除去未连接上的 SL0蛋白，加入封闭液，封闭2小时，离心去上清即得；所述封闭液为含有0. 1% (质量百分 比）脱脂奶粉、〇. 2mmol/L的甘氨酸；所述复合SL0致敏颗粒的制备采用物理吸附与化学交 联相结合实现链球菌溶血素0抗原与胶乳颗粒的交联。 优选地，所述AS0浓度分别为75、150、300和600U/mL。 优选地，所述校准品牛血清基质中溶质及其含量为：防腐剂0. 2?2. 2 %、吐 温-201?10%、保护剂1?3%、AS0。 优选地，所述校准品中所述防腐剂为叠氮钠；所述保护剂包括甘油、蔗糖、牛血清 白蛋白（BSA)、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。 与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果： (1)本专利技术试剂盒校准品质控品采用牛血清基质，该牛血清基质由无HBV、HIV、 HAV、HCV、TP传染源，对操作者危害极小； (2) R2试剂采用物理吸附与化学交本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种SLO蛋白的真核表达，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)采用真核表达系统，将SLO基因克隆于表达载体的多克隆位点，得到重组载体；所述真核表达系统为高保真的甲醇酵母菌表达系统；(2)重组载体转化到宿主细胞大量扩增后提取重组质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞；(3)重组质粒线性化；所述线性化是由SalI进行限制性酶切；(4)接着用电击转化法将线性化的重组质粒转入酵母菌；(5)将步骤(4)得到的酵母菌先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度后，以甲醇为唯一碳源诱导表达外源SLO蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟奇，陈瑛，房君江，张秀文，林清玉，
申请(专利权)人：上海睿康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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