组织损伤修复中的基质细胞衍生因子1的蛋白酶抗性突变体制造技术

本发明专利技术涉及基质细胞衍生因子1的肽，所述肽已突变，使得其抵抗蛋白酶二肽基肽酶IV(DPPIV)以及基质金属蛋白酶2(MMP-2)的消化，但仍保持天然SDF-1吸引T细胞的能力。突变体可粘附至自组装肽形成的膜，然后在组织损伤部位移植以辅助促进修复。

【技术实现步骤摘要】
组织损伤修复中的基质细胞衍生因子1的蛋白酶抗性突变体本申请是国际申请日为2007年10月22日、国际申请号为PCT/US2007/022394、进入国家阶段的申请号为200780039382.7、专利技术名称为“组织损伤修复中的基质细胞衍生因子1的蛋白酶抗性突变体”的PCT申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2007年6月22提交的美国临时申请60/929,353以及2006年10月23日提交的美国临时申请60/853,441的优先权和权益。这些在先申请的内容在此通过引用的方式整体并入。
本专利技术涉及基质细胞衍生因子1(SDF-1)的肽，所述肽采用以下方式突变，所述方式保留其吸引细胞的能力但使其抵抗蛋白酶(特别是基质金属蛋白酶2(MMP-2)和/或二肽基肽酶IV(DPPIV/CD26))导致的灭活。当其被递送到损伤组织时，这些突变体促进组织修复。所述肽在许多状况(包括胃肠道或其它位置的溃疡，意外、手术或疾病造成的创伤，以及心肌梗塞造成的心脏组织损伤)的治疗中也应当是有效的。所述肽在使糖尿病患者对创伤、溃疡或病变引起的伤害敏感性下降的治疗中也应是有效的。在一个特别优选的实施方式中，利用自组装肽形成的膜将SDF-1的突变形式递送到损伤组织。
技术介绍
基质细胞衍生因子1(SDF-1，或CXCL12)是吸引静息T淋巴细胞、单核细胞以及CD34+干细胞的趋化因子家族中的68个氨基酸的成员。通常发现它有两种不同的形式SDF-1α和SDF-1β，其是差异mRNA剪接的结果(US5,563,048)。除了SDF-1β在C末端有4个氨基酸(-Arg-Phe-Lys-Met)的延伸外，这些形式是基本上相同的。两种形式的SDF-1都以21个氨基酸长度的信号肽起始，所述的信号肽被切割以形成活性肽(US5,563,048)。就本专利技术而言，应当理解术语“SDF-1”指的是所述肽的活性形式(即在切割信号肽之后)，并包含SDF-1α和SDF-1β。还发现了全长68个氨基酸的SDF-1序列并不是活性所需的。具有SDF-1至少前8个N末端残基的肽保持全长肽的受体结合和生物活性，虽然其效力减弱。例如，SDF-1、1-8、1-9、1-9二聚体以及1-17诱导细胞内钙以及T淋巴细胞和CEM细胞中的趋化作用，并结合至CXC趋化因子受体4(CXCR4)。然而，天然的SDF-1在5nM下具有半最大的趋化活性，而1-9二聚体需要500nM，因而其效力是1/100。1-17以及1-9单体类似物的效力分别是SDF-1的1/400和1/3600。C末端环化的SDF-1变体已被描述，其具有更高的CXCR4受体结合亲和性，并且这种类型的环化可以(如果需要)用于连接本专利技术所描述的肽。就本专利技术而言，术语SDF-1将包括在C末端截短但仍保持SDF-1生物学活性(即趋化T淋巴细胞和CEM细胞以及结合至CXC趋化因子受体4(CXCR4))的肽的形式。在最低限度上，这些截短形式包括所述肽N末端的前8个氨基酸。SDF-1在胚胎发育期间(Nagasawa等，Nature382：635-638(1996)；Zou等，Nature393：595-599(1998))以及干细胞移植后(Lapidot等，Blood106：1901-1910(2005))造血干细胞归巢至骨髓中起关键作用。除了在干细胞归巢中的作用，SDF-1在心脏发生以及血管生成中也很重要。SDF-1缺陷小鼠在围产期死亡并且在心室间隔形成、骨髓造血以及器官特异的血管生成中有缺陷(Nagasawa等，Nature382：635-638(1996)；Zou等，Nature393：595-599(1998))。还有报道说异常低水平的SDF-1至少部分地对糖尿病患者的创伤愈合有损害，并且这种损害可以通过在组织损伤部位施用这种细胞因子而逆转(Gallagher等，J.ClinInvest.117：1249-1259(2007))。在正常成年人心脏中，SDF-1持续表达，但其表达在心肌梗塞后的数天内上调(Pillarisetti等，Inflammation25：193-300(2001))。Askari等通过心肌内移植过表达SDF-1的稳定转染心成纤维细胞并联合G-CSF治疗，在心肌梗塞后8周增加SDF-1表达(Lancet362：667-703(2003))。这与心脏中更高数量的骨髓干细胞(c-Kit或CD34阳性)和内皮细胞相关，并导致血管密度上升以及左心室功能改善。这些研究提示，天然发生的心肌修复过程的不足部分地归结于SDF-1可用度的不够。因此，在心肌梗塞后以受控的方式递送SDF-1可以吸引更多前体细胞从而促进组织修复(Penn等，Int.J.Cardiol.95(Suppl.1)：S23-S25(2004))。除此之外，SDF-1的施用可用于改善患者尤其是糖尿病患者的创伤或溃疡的愈合。可用于在组织损伤部位持续递送药物的一个方式是通过生物相容性膜的应用。某些肽在与低浓度的单价金属阳离子孵育时能够自组装(U.S.5,670,483；U.S.6,548,630)。组装导致无毒性、无免疫原性以及对于蛋白酶相对稳定的凝胶样膜的形成。一旦形成，膜在血清、水溶液以及细胞培养基质中是稳定的。它们可在无菌条件下制备，能够支持细胞生长并在移植入动物体内时缓慢地消化。这些特性使得所述的膜非常适合作为治疗剂递送的设备(US20060148703以及20060088510)。
技术实现思路
本专利技术部分基于将以下作为前提的实验：基质细胞衍生因子1(SDF-1)在损伤的心脏组织恢复中的有益效果受该组织中高浓度的蛋白酶基质金属蛋白酶2(MMP-2)所限制。更具体地，我们提出MMP-2切割SDF-1并因而消除了其吸引前体细胞至组织损伤部位的能力。为了验证这个前提，本专利技术人开发了保留吸引T细胞能力但抗MMP-2消化的SDF-1的突变形式。所述的mSDF-1肽粘附至特别设计的由自组装肽形成的膜，然后在心脏损伤的动物模型中验证。发现粘附至膜并植入到实验动物心肌的mSDF-1，相对于未粘附至膜的SDF-1或mSDF-1，更大程度地促进心脏的恢复。此外，本专利技术人发现SDF-1的截短形式保持和全长肽一样的生物活性，第四位或第五位氨基酸上的突变保护肽不受蛋白酶消化。在本专利技术的第一个方面，本专利技术涉及SDF-1的突变形式(mSDF-1)，所述突变形式的特征在于，未突变SDF-1的N末端的第四位和/或第五位氨基酸改变(KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNK(SEQIDNO：52))。由此，第四位氨基酸改变为非S氨基酸和/或第五位氨基酸改变为非L氨基酸。如上面所讨论的，如果存在前八个氨基酸(上面序列中高亮显示的序列)，则全长SDF-1肽的截短形式保持生物活性，并且，这些截短形式也可通过突变第四和/或第五位而具有蛋白酶抗性。本专利技术也包括这些生物活性的截短突变体。提出了另一途径，本专利技术包括至少包含SEQIDNO：52的1-8位氨基酸的肽，其可选地在C末端延伸SEQIDNO：52剩余序列(如9-68位氨基酸所示)的所有或任意部分。在所有这些情况中，所述肽具有对应于SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的突变基质细胞衍生因子1（SDF‑1)肽，包括通式mSDF‑1或Xp‑mSDF‑1，其中所述SDF‑1是包含SEQ ID NO:52的至少氨基酸1‑8的氨基酸序列的肽，并且其任选在C末端延伸SEQ ID NO:52的剩余序列的全部或任意部分，所述SEQ ID NO:52的剩余序列如氨基酸9‑68所示，并且其中：a） X是蛋白氨基酸或蛋白酶保护性有机基团；b） p是1到4之间的整数；c） mSDF‑1是包含所述SDF‑1 N末端的第四和/或第五位氨基酸突变的所述SDF‑1的突变形式，其中mSDF‑1具有对T细胞的趋化活性，并且其被基质金属蛋白酶2（MMP‑2）灭活的速率低于天然SDF‑1肽灭活速率的二分之一；和d） Xp‑mSDF‑1是包含所述SDF‑1 N末端的第四和/或第五位氨基酸突变的所述SDF‑1的突变形式，其中Xp‑mSDF‑1具有对T细胞的趋化活性，其被二肽基肽酶IV（DPPIV）灭活的速率低于天然SDF‑1灭活速率的二分之一，并且其被MMP‑2灭活的速率低于天然SDF‑1灭活速率的二分之一。

【技术特征摘要】
2006.10.23 US 60/853441;2007.06.22 US 60/929353;201.一种分离的突变基质细胞衍生因子1（SDF-1)肽，由通式mSDF-1或Xp-mSDF-1组成，其中所述mSDF-1由SEQIDNO:54的至少氨基酸1-17的氨基酸序列组成，并且其任选在C末端延伸至SEQIDNO:54的18-68的任意位氨基酸位置，并且其中：a）X是蛋白氨基酸或蛋白酶保护性有机基团；和b）p是1到4之间的整数。2.权利要求1的分离的突变基质细胞衍生因子1（SDF-1)肽，其中所述mSDF-1肽由SEQIDNO:65的氨基酸序列组成。3.权利要求2的分离的突变基质细胞衍生因子1（SDF-1)肽，其中所述肽由通式Xp-mSDF-1组成，其中X是丝氨酸并且p是1。4.由通式A-(L)n-(R)q组成的融合蛋白，其中：A是权利要求1的分离的突变基质细胞衍生因子1（SDF-1)肽，n是1，q是1，L是3-9个氨基酸的连接序列，和R是选自下列的自组装肽：AKAKAEAEAKAKAEAE(SEQIDNO:1);AKAEAKAEAKAEAKAE(SEQIDNO:2);EAKAEAKAEAKAEAKA(SEQIDNO:3);KAEAKAEAKAEAKAEA(SEQIDNO:4);AEAKAEAKAEAKAEAK(SEQIDNO:5);ADADARARADADARAR(SEQIDNO:6);ARADARADARADARAD(SEQIDNO:7);DARADARADARADARA(SEQIDNO:8);RADARADARADARADA(SEQIDNO:9);ADARADARADARADAR(SEQIDNO:10);ARADAKAEARADAKAE(SEQIDNO:11);AKAEARADAKAEARAD(SEQIDNO:12);ARAKADAEARAKADAE(SEQIDNO:13);AKARAEADAKARADAE(SEQIDNO:14);AQAQAQAQAQAQAQAQ(SEQIDNO:15);VQVQVQVQVQVQVQVQ(SEQIDNO:16);YQYQYQYQYQYQYQYQ(SEQIDNO:17);HQHQHQHQHQHQHQHQ(SEQIDNO:18);ANANANANANANANAN(SEQIDNO:19);VNVNVNVNVNVNVNVN(SEQIDNO:20);YNYNYNYNYNYNYNYN(SEQIDNO:21);HNHNHNHNHNHNHNHN(SEQIDNO:22);ANAQANAQANAQANAQ(SEQIDNO:23);AQANAQANAQANAQAN(SEQIDNO:24);VNVQVNVQVNVQVNVQ(SEQIDNO:25);VQVNVQVNVQVNVQVN(SEQIDNO:26);YNYQYNYQYNYQYNYQ(SEQIDNO:27);YQYNYQYNYQYNYQYN(SEQIDNO:28);HNHQHNHQHNHQHNHQ(SEQIDNO:29);HQHNHQHNHQHNHQHN(SEQIDNO:30);AKAQADAKAQADA...

【专利技术属性】
技术研发人员：R李，V赛格斯，
申请(专利权)人：布里格哈姆及韦门斯医院，
类型：发明
国别省市：美国;US