楼来牛胚胎冷冻液、冷冻方法及解冻方法技术

本发明专利技术公开一种用于楼来牛胚胎冷冻液、冷冻方法及解冻方法，属生物工程及胚胎遗传技术领域。楼来牛胚胎冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO。冷冻方法包括胚胎的获取、冷冻预处理、胚胎装管和胚胎冷冻。解冻方法是麦管在空气中停留5-10s后，放入35-38℃水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800µl/孔的液滴中，每次停留时间均为5min；胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛。本发明专利技术冷冻液、冷冻方法及解冻方法具有冷冻效果好，可操作性强、操作方便、利于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种用于，属生物工程及胚胎遗传
。楼来牛胚胎冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMS0?冷冻方法包括胚胎的获取、冷冻预处理、胚胎装管和胚胎冷冻。解冻方法是麦管在空气中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，将胚胎检出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入WM2和含HM为800rt/孔的液滴中，每次停留时间均为5min;胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者移植到已经同期发情处理的受体母牛。本专利技术冷冻液、冷冻方法及解冻方法具有冷冻效果好，可操作性强、操作方便、利于推广应用。【专利说明】
本专利技术涉及生物工程及胚胎遗传
，特别涉及一种用于楼来牛胚胎冷冻 液、冷冻方法及解冻方法。
技术介绍
胚胎冷冻保存技术是胚胎移植技术进入产业化推广应用和发展阶段的关键环节。 该技术可以使胚胎移植不受时间、地域限制，简化活畜运输和引种的费用，防止疫病传播 等。利用这项技术还可以建立良种家畜和濒危动物胚胎库，有效地保存各种优良品种和濒 危物种的遗传资源。目前在胚胎冷冻保存研究中主要是寻求毒性低的抗冻保护剂、有效合 理、易于操作的方法以及胚胎对低温敏感的决定性因素等方面进行研究，并试图从动物基 因型、胚胎细胞结构特点等方面寻求突破点，提高胚胎冷冻的效果。 在胚胎冷冻过程中，正确的操作方法、抗冻保护剂的选择和合理搭配、严格的解冻 方法对减少由于冷冻给胚胎造成的损伤显得尤为重要。国内外对于操作的规范化、抗冻保 护剂的合理搭配等方面都进行了研究，但如何合理的在保证正确的操作前提下，冷冻液中 加入冷冻保护剂的种类与冷冻程序都密切关系到胚胎冷冻、解冻后的存活率与其随后的受 胎率。胚胎冷冻过程中，常用的冷冻保护剂是甘油、乙二醇和蔗糖。用上述三种冷冻保护剂 对牛体内胚胎进行冷冻，胚胎的冷冻效果不尽相同，解冻后的存活率及妊娠率受到不同程 度影响，这成为了限制牛胚胎移植技术进一步发展的一大难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决胚胎冷冻效果不同的难题，提供一种冷冻效果好，方法简便， 解冻后复苏率高，易于楼来牛在生产应用推广，采用乙二醇、蔗糖、DMS0作为冷冻剂对楼来 牛体内胚胎进行冷冻保存，为实现本专利技术目的所使用的技术方案是： 一种楼来牛胚胎冷冻液，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMS0 ;所述的各组分重量份数为 乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMS080-100 ;所述的冷冻液还包括TCM-HEPES ;配制时，将蔗 糖溶解于TCM-HEPES中。乙二醇、二甲亚砜是低分子中性物质，属渗透型抗冻剂，在溶液中 易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，起到保护作 用。而蔗糖属非渗透型抗冻剂，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态。 所述的乙二醇 95-100、蔗糖 50-55 和 DMS085-95,所述的 TCM-HEPES 含 20%FCS，所 述的蔗糖浓度为25-30%。 所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMS090-100,所述的蔗糖浓度为26-29%。 -种楼来牛胚胎冷冻方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMS0冷冻，具体步骤 如下： (1)胚胎的获取，取第5?8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培养皿中；筛选出优 秀胚胎和优良胚胎； (2) 冷冻预处理，将筛选的胚胎在HM液洗涤2-5次后，移入至VS1液，停留l-3min后， 再移入VS2液中，备用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES ;所述的VS1是80〇μ1 HM、 ΙΟΟμΙ EG 和 ΙΟΟμΙ DMSO ;所述的 VS2 是 60〇μ1 ΗΜ、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0 ; (3) 胚胎装管，麦管先吸入2P1VS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤（2)中含有胚胎的 VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存； (4) 胚胎冷冻，将步骤（3)装管的胚胎进行冷冻，在液氮面停留30-50S后浸入到液氮中 冷冻。 所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2,所述的培养 皿直径为35mm。 所述的胚胎在HM液中洗涤2-3次，移入VS1液，停留时间l-2min。 一种楼来牛胚胎解冻方法，将以上冷冻的胚胎进行解冻，将麦管从液氮中取出， 在空气中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，将胚胎检出移到丽1液滴中后，移入 含相同溶液的另一孔液滴中，再分别移入丽2和含HM为80〇μ1 /孔的液滴中，每次停留 时间均为5min ;胚胎在培养液中洗涤三次后，在培养液中继续培养观察胚胎发育情况或者 移植到已经同期发情处理的受体母牛；所述的丽1是ΗΜ80〇μ1和SM40(^1 ;所述的丽2是 ΗΜ800μ1+5Μ200μ1 ;所述的 SM 液是含 28. 5% 蔗糖（W/V) TCM-HEPES。 所述的培养液是WM1、WM2和ΗΜ，在空气中停留5-8s，放入35-36°C水浴10-12s。 本专利技术的有益效果在于：冷冻效果比常用甘油、乙二醇和蔗糖提高10-20%，使用 该试剂解冻后解冻后可获得90%以上复苏率及85%以上的孵化率，胚胎移植妊娠率达到55% 以上。使用该方法操作简便，易于在生产中应用推广的胚胎冷冻保存方法，可操作性强、操 作方便、利于推广应用。 【具体实施方式】 一种楼来牛胚胎冷冻液，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMS0 ;所述的各组分重量份 数为乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMS080-100 ;所述的冷冻液还包括TCM-HEPES ;配制时， 将蔗糖溶解于TCM-HEPES中。 所述的乙二醇 95-100、蔗糖 50-55 和 DMS085-95,所述的 TCM-HEPES 含 20%FCS，所 述的蔗糖浓度为25-30%。 所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMS090-100,所述的蔗糖浓度为26-29%。 一种楼来牛胚胎冷冻方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMS0冷冻，具体步骤 如下： (1) 胚胎的获取，取第5?8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培养皿中；筛选出优 秀胚胎和优良胚胎； (2) 冷冻预处理，将筛选的胚胎在HM液洗涤2-5次后，移入至VS1液，停留l-3min后， 再移入VS2液中，备用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES ;所述的VS1是80〇μ1 HM、 10〇μ1 EG 和 10〇μ1 DMS0 ;所述的 VS2 是 60〇μ1 ΗΜ、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0 ; (3) 胚胎装管，麦管先吸入2P1VS1液后，吸入空气泡，然后吸入步骤（2)中含有胚胎的 VS2液后，继续吸入空气泡，最后以VS1液封存； (4)胚胎冷冻，将步骤（3)装管的胚胎进行冷冻，在液氮面停留30-50s后浸入到液氮中 冷冻。 所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2,所述的培养 皿直径为35mm。 所述的胚胎在HM液中洗涤2-3次，移入VS1液，停留时间l-2min。 -种楼来牛胚胎解冻方法，将以上冷冻的胚胎进行解冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种楼来牛胚胎冷冻液，其特征在于，冷冻液包括乙二醇、蔗糖和DMSO；所述的各组分重量份数为乙二醇90‑100、蔗糖45‑60和DMSO80‑100；所述的冷冻液还包括TCM‑HEPES；配制时，将蔗糖溶解于TCM‑HEPES中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋和生，
申请(专利权)人：南宁培元基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45