本发明专利技术公开了一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌。它其是转有冬虫夏草丝氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表达丝氨酸水解酶Csp1或Csp2的蛹虫草，所述的丝氨酸水解酶基因csp1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的丝氨酸水解酶基因csp2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。转外源丝氨酸水解酶基因确实提高了蛹虫草感染大蜡螟的能力，本发明专利技术为提高蛹虫草侵染昆虫能力提供技术参考。
【技术实现步骤摘要】
一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌
：本专利技术属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌。
技术介绍
：昆虫致病真菌的丝氨酸蛋白水解酶一般都有降解昆虫表皮的功能(Joshietal.，1995)，它是一类具有相同催化机制的蛋白酶家族，作用于大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。丝氨酸蛋白水解酶催化激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的。在酵母体系中表达的蛋白酶具有一定的翻译后加工能力，使收获的外源蛋白有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，因此酵母体系表达的蛋白有一定的功能(王世华等，2007)。来源于冬虫夏草的csp1和csp2基因是两个丝氨酸蛋白酶，可以水解昆虫角质层，属于蛋白酶S8A亚家族成员；研究表明在酵母细胞中表达的冬虫夏草丝氨酸蛋白酶有降解昆虫体壁的能力(Zhangetal.，2008b)。蛹虫草感染昆虫的能力是评价蛹虫草性状的一个重要指标。提高真菌感染寄主能力的研究常见于生物防治真菌如白僵菌、绿僵菌中，主要是通过转一个相关基因到真菌细胞中以提高其感染寄主昆虫能力。例如转Bt毒力基因、丝氨酸蛋白类基因、凝集素基因(Callaghanetal.，2005；Luetal.，2008；Fangetal.，2010)等有利于真菌加速入侵昆虫体壁。本研究通过ATMT方法整合冬虫夏草的丝氨酸水解酶基因到蛹虫草基因组DNA中，以期提高蛹虫草JM4菌株侵染大蜡螟的能力。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌。本专利技术的能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌，是转有冬虫夏草丝氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表达丝氨酸水解酶Csp1或Csp2的蛹虫草，所述的丝氨酸水解酶基因csp1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的丝氨酸水解酶基因csp2，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本研究利用ATMT方法构建了转冬虫夏草丝氨酸水解酶基因(csp1，csp2以及两者融合的基因c0c2)蛹虫草JM4，获得的突变子可通过绿色荧光鉴定。通过RT-PCR、Southernblot、Westernbolt和子实体培养等方法筛选到一批生长特征正常的突变子，进行大蜡螟末龄幼虫感染实验。大蜡螟末龄幼虫感染实验发现，转csp1、csp2、c0c2的突变菌株对蜡螟末龄幼虫的致死能力显著提高，但是c0c2(融合csp1和csp2两个基因)蛹虫草突变菌株的昆虫感染能力并没有比单个基因(csp1或csp2)的突变菌株高。总之，转外源丝氨酸水解酶基因确实提高了蛹虫草感染大蜡螟的能力，本专利技术为提高蛹虫草侵染昆虫能力提供技术参考。附图说明：图1是pKHt-gfp载体图；图2是扩增csp1、csp2、c0c2基因片段；M：DL2000DNAMarker1：空白对照；2-5：分别是csp1、csp2、c0和c2的PCR产物；6-7：PCR融合产物c0c2图3是大肠杆菌DH5α/pKgc0c2的菌落PCR鉴定，M：DL2000DNAMarker；1-6：以csp1-F和csp2-R引物对扩增pKgc0c2菌落的PCR产物；图4是大肠杆菌DH5α/pKgcsp1和pKgcsp2的菌落PCR鉴定，M：DL2000DNAMarker；1-6：以csp1引物扩增pKgcsp1菌落的PCR产物，7-12：以csp2引物扩增pKgcsp2菌落的PCR产物图5是pKgcsp1和pKgcsp2质粒的HindⅢ和kpnⅠ双酶切鉴定，M：WideRangeDNAMarker(100-6000bp)，1-3：pKgcsp1质粒的HindⅢ和KpnⅠ双酶切结果，4-6：pKgcsp2质粒的HindⅢ和KpnⅠ双酶切结果；图6是pKgc0c2质粒的HindⅢ和KpnⅠ双酶切鉴定，M：λ-HindⅢdigestDNAMarker；1-3：pKgc0c2质粒的HindⅢ和KpnⅠ双酶切结果；图7是野生型蛹虫草JM4及几个突变子的总RNA，M：DL2000DNAMarker，1-11：野生型JM4及几个突变子的总RNA；图8是3种蛹虫草转化子的PCR鉴定，M：DL2000DNAMarker，1-4：PCR扩增pKg突变子中lac-gfp基因，5-11：PCR扩增pKgcsp1突变子中csp1基因12-16：PCR扩增pKgcsp2突变子中csp2基因；图9是蛹虫草pKgc0c2转化子的PCR鉴定，M：DL2000DNAMarker，1、6：分别扩增野生型JM4的csp1和csp2基因的PCR产物，2-5：扩增pKgc0c2突变子中csp1基因的PCR产物；7-10：扩增pKgc0c2突变子中csp2基因的PCR产物；图10是蛹虫草突变子的绿色荧光检测，CK：野生型JM4，A1-A3：pKg突变子，B1-B3：pKgcsp1突变子，C1-C3：pKgcsp2突变子，D1-D3：pKgc0c2突变子；图11是转丝氨酸水解酶基因的蛹虫草子实体，CK：野生型JM4子实体A，B：转丝氨酸水解酶基因突变子的子实体；图12是蛹虫草JM4基因组DNA提取，M.：λ-HindIIIdigestDNAmarker，1：野生型JM4基因组DNA，2-4.转丝氨酸水解基因的蛹虫草突变子基因组DNA；图13是3个基因的PCR纯化产物，M：DL2000DNAMarker，1：gfpPCR纯化产物，2：csp1PCR纯化产物，3：csp2PCR纯化产物；图14是探针灵敏性鉴定，1：gfp探针，2：csp1探针，3：csp2探针；图15是蛹虫草转化子的southernblot鉴定(HindⅢ消化)；探针：DIG-标记的gfp片段；M：DNAMolecular-WeightMarkerⅡDIG-Labelde0.12-23.1Kb；C：JM4基因组DNA酶切产物；C1：pMD-19+gfp+gpd片段；C2：pMD-19+gfp+csp1片段，C3：pMD-19+gfp+csp2片段；1-3：三个pKg转化子的基因组DNA酶切产物；4-6：三个pKgcsp1转化子的基因组DNA酶切产物；7-9：三个pKgcsp2转化子的基因组DNA酶切产物；10-12：三个pKgc0c2转化子的基因组DNA酶切产物。图16是Tail-PCR扩增部分转化子的侧翼序列；M：DL2000DNAMarker1-3:不同转化子的第一、二、三轮Tail--PCR反应产物；图17是pET-28a-csp1和pET-28a-scsp2重组质粒的酶切鉴定；M：WideRangeDNAMarker(100-6000bp)；1-2：pET-28a-csp1重组质粒HindⅢ和BamHI的酶切结果；3-4：pET-28a-scsp2重组质粒HindⅢ和BamHI的酶切结果；图18是Csp1和Scsp2蛋白的原核表达；M：PrestainedProteinLadder；1，3：未诱导和已诱导的Transetta(DE3)/pET-28a-scsp2重组菌；2，4：未诱导和已诱导的Transetta(DE3)/pET-28a-csp1重组菌；图19是纯化的Csp1和Scsp2蛋白浓度分析；M：PrestainedProteinLad本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌，其特征在于，其是转有冬虫夏草丝氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表达丝氨酸水解酶Csp1或Csp2的蛹虫草，所述的丝氨酸水解酶基因csp1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的丝氨酸水解酶基因csp2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种能提高蛹虫草感染寄主昆虫能力的蛹虫草工程菌，其特征在于，其是转有冬虫夏草丝氨酸水解酶基因csp1或csp2，并能表达丝氨酸水解酶CSP1或CSP...
【专利技术属性】
技术研发人员：江克清，韩日畴，
申请(专利权)人：广东省昆虫研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。