一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法。该方法包括：通过生物复合酶法制得马银花叶酶解物，通过虎奶菌接种于添加有龙脑樟的培养基中培养制得龙脑樟降解物，在桑黄液体发酵培养第1天-5天加入马银花叶酶解物和谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天-6天后加入龙脑樟降解物和α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天-5天得到桑黄液体发酵液。本发明专利技术根据药用真菌桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性，产品附加值高，是一种极具工业化前景的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法
本专利技术属于发酵工程领域，具体涉及一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法。
技术介绍
桑黄(Phellinusigniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄有效成分由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。作为目前国际公认的抗癌效果最好的大型药用真菌，桑黄抑制肿瘤的研究主要集中在药理活性成分桑黄多糖上。漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一种最简单的含铜的多酚氧化酶，它能够催化酚类化合物脱去羟基上的电子或者质子，从而形成自由基，导致木质素及酚类化合物裂解，同时氧被还原为水。漆酶是白腐菌分解木质素的主要酶源之一。微生物发酵是一个十分复杂的生物化学反应过程。有些次生代谢产物的合成代谢非常复杂，发酵过程的细微差别都会引起产物代谢的不同响应。在真菌不同生长阶段用外源刺激物处理，其细胞生长和次级代谢产物的积累程度不同。因此，通过采用外源刺激物对代谢产物的生物合成进行调控是获得高活性目标产物的主要途径。通过不同发酵阶段添加不同的复合外源刺激物同时促进桑黄多糖和漆酶产量，并提高其生物活性尚未见报道。中国专利ZL200910229843.8公开了一种利用真菌诱导子提高桑黄黄酮产量的桑黄菌丝体液体发酵方法，其将真菌诱导子菌种接种活化培养后，取菌块接种培养过滤得到真菌诱导子菌丝体；然后烘干研磨破碎加入乙醇浸泡，过滤并收集滤渣，滤渣依次加入氯仿和正丁醇的混合液、丙酮、水冲洗，风干后干物质加入三氟乙酸，沸水浴0.5-2小时，然后过滤，取滤液中和、静置、0.45μm微孔滤膜过滤除菌，制成真菌诱导子，-10℃至-20℃冷冻保存；将桑黄菌种接种活化培养，后取菌块接种发酵培养；在桑黄液体发酵培养第1-5天，加入真菌诱导子继续培养得到桑黄菌丝体，该方法工艺简单、成本低、效果显著，可大幅度提高桑黄细胞黄酮含量，是一种极具工业化前景的生产方法。这种方法是以桑黄黄酮含量为指标，通过加入真菌诱导子培养得到桑黄菌丝体，以提高桑黄细胞黄酮含量。中国专利申请CN201010226645.9公开了一种运用植物油用于药用真菌桑黄菌液体培养并提高桑黄菌丝量的方法。培养基初始pH控制在5.5-7.5，灭菌温度115℃-121℃，灭菌时间30min。在发酵初始添加质量浓度为0.5％-5％的不同种类的植物油，包括大豆油、橄榄油、菜籽油等，采用摇瓶发酵或发酵罐发酵工艺，接种量为5％-15％，培养温度为24℃-28℃。这种方法仅以桑黄菌丝量为唯一指标，通过在培养基中添加适量的植物油，油脂类物质在桑黄液体发酵中一方面可以作为消泡剂，另一方面可以作为碳源，可以提高桑黄菌丝体生物量。中国专利申请CN201010151147.2公开了一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法。该技术是利用灵芝细胞的液体培养，通过在细胞生长的适宜阶段，加入真菌诱导子，诱导一定时间后，可显著提高灵芝漆酶产量，真菌诱导子诱导5-8天后，可使灵芝漆酶酶活最高达到1068.4U/L，是对照组的2.2倍。这种技术仅以生物量、黄酮等单一产物为目标，并未涉及根据药用真菌多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加特定的复合外源刺激物来同时促进桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足而提供一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，该方法通过在不同发酵阶段添加不同的复合外源刺激物有助于提高桑黄胞内多糖和漆酶产量，并促进代谢产物活性提高。本专利技术采用的技术方案是：一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，包括步骤：(1)桑黄的液体发酵培养：将活化后的桑黄菌种接种于添加桑枝提取物的液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养；(2)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：在桑黄液体发酵培养第1天-5天，加入占液体种子培养基体积0.02％-0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％-0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天-6天后，加入占液体种子培养基体积0.01％-0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％-0.08％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天-5天，得到桑黄液体发酵液。本专利技术根据药用真菌桑黄液体发酵多糖和漆酶特定代谢产物合成代谢途径的特点，通过在不同发酵阶段添加不同配比的复合外源刺激物，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度同时提高桑黄胞内多糖和胞外漆酶产量和生物活性。所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinuslinteus)ACCC51181菌种购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。为了达到更好的专利技术效果，进行以下优选：步骤(1)中，所述的桑枝提取物的添加量为液体种子培养基体积的5％-10％。本专利技术，添加的桑枝提取物等会溶解于液体种子培养基中，因此添加桑枝提取物前后的液体种子培养基总体积不变。所述的桑枝提取物可以选用市售产品，优选采用以下制备方法制备的桑枝提取物，包括：称取一定量的桑枝条，粉碎(优选过40目-100目)，先加占桑枝条重量8倍量-10倍量质量百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液在80℃-85℃浸提1.5h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量8倍量-10倍量水在95℃-100℃下浸提2h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。所述的桑黄液体发酵培养的温度为20℃-30℃。步骤(1)中，桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，包括：将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度22℃-30℃，培养时间4天-10天。所述的PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO41g和MgSO40.5g，用水定容至1000mL。步骤(2)中，所述的马银花叶酶解物的制备方法，包括：将马银花叶加水磨成浆液，灭酶；调节浆液pH4.0-5.5，加入由纤维素酶和半纤维素酶构成的第一复合酶，在40℃-50℃进行酶解反应0.5小时-1.5小时，灭酶后调节浆液pH5.0-7.0，加入由木瓜蛋白酶和中性蛋白酶构成的第二复合酶，于50℃-60℃进行酶解反应1小时-1.5小时，灭酶后离心，上清液经过滤、浓缩和干燥，得到马银花叶酶解物。所述的第一复合酶与马银花叶的质量比优选为1：30-50。所述的第二复合酶与马银花叶的质量比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，其特征在于，包括步骤：(1)桑黄的液体发酵培养：将活化后的桑黄菌种接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养；(2)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：在桑黄液体发酵培养第1天‑5天，加入占液体种子培养基体积0.02％‑0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％‑0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天‑6天后，加入占液体种子培养基体积0.01％‑0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％‑0.08％的α‑蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天‑5天，得到桑黄液体发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种同时提高桑黄液体发酵多糖和漆酶产量及活性的方法，其特征在于，包括步骤：(1)桑黄的液体发酵培养：将活化后的桑黄菌种接种于添加有桑枝提取物的液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养；(2)外源刺激物对桑黄细胞的诱导培养：在桑黄液体发酵培养第1天-5天，加入占液体种子培养基体积0.02％-0.6％的马银花叶酶解物和占液体种子培养基体积0.02％-0.1％的谷氨酰胺进行第Ⅰ阶段发酵培养，继续培养2天-6天后，加入占液体种子培养基体积0.01％-0.5％的龙脑樟降解物和占液体种子培养基体积0.01％-0.08％的α-蒎烯进行第Ⅱ阶段发酵培养，然后继续培养1天-5天，得到桑黄液体发酵液；将桑黄液体发酵液用多层纱布过滤，从过滤所得菌丝体中提取桑黄胞内多糖；滤液常温下离心，取离心上清液即为粗酶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的桑枝提取物的添加量为液体种子培养基体积的5％-10％。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的桑枝提取物的制备方法，包括：称取一定量的桑枝条，粉碎，先加占桑枝条重量8倍量-10倍量质量百分浓度为70％-80％的乙醇水溶液在80℃-85℃浸提1.5h-2h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅰ；上述醇提后的桑枝残渣加占桑枝条重量8倍量-10倍量水在95℃-100℃下浸提2h-2.5h，过滤后得到上清液，上清液浓缩真空冷冻干燥后得提取物Ⅱ；合并所述提取物Ⅰ和提取物Ⅱ得桑枝提取物。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：程俊文，贺亮，胡传久，魏海龙，付立忠，李海波，邹景泉，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33