本发明专利技术提供一种设计及产生比较于亲代多肽而具有改变功能的甘油脱氢酶(GlyDH)变体的方法。本发明专利技术更提供一种编码比较于亲代多肽而具有改变功能的GlyDH多肽变体的核酸。本发明专利技术的各种实施形态中也提供包含编码GlyDH变体的多核苷酸的宿主细胞和制造乳酸的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供一种设计及产生比较于亲代多肽而具有改变功能的甘油脱氢酶(GlyDH)变体的方法。本专利技术更提供一种编码比较于亲代多肽而具有改变功能的GlyDH多肽变体的核酸。本专利技术的各种实施形态中也提供包含编码GlyDH变体的多核苷酸的宿主细胞和制造乳酸的方法。【专利说明】具有D-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途 相关申请的前后参照 本申请要求2011年10月4日提出的美国临时专利申请序号第61/543003号的权益，特 此将该专利申请的公开内容完整加入作为参考，包括所有附图、表格和氨基酸或核酸序列。 本专利技术受政府支持由能源部（DE-FG36-04G014019号与DE-FG36-08G088142)与美 国农业部、国家食品和农业研究院（2011-10006-30358号）补助而成。政府在本专利技术中拥 有特定权利。
技术介绍
石油作为汽车燃料的首要来源以及用于有机化学和塑料的主要原料。石油储备的 有限性和使用石油的负面环境冲击，将注意力逐渐转移到可再生原料的替代物上（1?4)。 碳水化合物的发酵作用已被证明制造出短链氢氧基酸以及其他可被聚合成塑料并代替石 油的化学物质（5)。早在1895年时就已经开始使用纯细菌培养进行乳酸的商业化生产（6)， 而目前的年产量已超过300000公吨。虽然乳酸主要用于食品和药品产业，假设可以降低制 造聚乳酸生物聚合物（polylactic acid biopolymers，PLA)的成本，贝u制造 PLA的应用预 期将会超过其他的用途（7,8)。 乳酸被浓缩成乳酸交酯双体（lactide dimers)，纯化并聚合成热塑性塑料（7,9)。 混合D型（_)和L型（+)乳酸聚合物提供实质上控制物理及热化学特性与生物分解速率 (9)。虽然可以用石油人工合成出乳酸，化学合成制造出的异构物的混合物并不适合用于 PLA。合成PLA所需的旋光性纯乳酸可以通过微生物发酵快速制造（8)。通过乳酸细菌，例 如乳酸菌、乳酸球菌等等，从葡萄糖和蔗醣在介于30°C到40°C温度之间以高产率及滴度制 造出商业化L型（+)乳酸（8,10)。大肠杆菌（Escherichia coli)的衍生物是已知唯一商 业化D型㈠ 乳酸的生产者（11，12)并且也能在40°C以下达到最佳运作。 为了消除碳水化合物（葡萄糖、蔗醣）食物的使用，需要可发酵醣的替代来源，例 如木质纤维素生物量与改良的微生物性生物催化剂以用于乳酸的制造（13)。然而，使用纤 维素作为原料的商业化真菌纤维素意味着可观的制造成本。可以通过有效率地在最佳用于 真菌纤维素的环境（PH5. 0,50°C )下发酵的耐热性生物催化剂的开发而减少所述成本（14， 15)。 通过磷酸乙酮醇酶途径的工业代谢性五碳醣（从半纤维素）所使用的乳酸生物催 化剂，阻止这些醣高效率的转换成乳酸。使用该途径从五碳醣制造的乳酸被等摩尔量的乙 酸所污染（图1) (8,16?18)。为了提升这些乳酸细菌的木糖发酵性质所做的尝试仅获得 有限的成功（18，19)。虽然在半纤维素中所有的五碳醣都被大肠杆菌（E. coli)衍生物有 效率地通过五碳醣-磷酸途径发酵成D型（-)或L型（+)乳酸，这种生物催化剂的温度或 pH值容忍度仍不足以允许用于在商业化纤维素的最佳温度（50°C )或pH值（5.0)下的纤 维素发酵（20)。 凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans)具有多种将木质纤维素醣发酵成乳酸的 期望特性。这种细菌利用高效率五碳醣-磷酸途径在用于商业化真菌纤维素的最佳环境 50-55°C及pH值5. 0下将五碳醣和六碳醣发酵成L型（+)乳酸（图1) (15,17, 21)。原生菌 株在葡萄糖或木糖进行补料分批发酵下，产生浓度高达180g Γ1的旋光性纯L型（+)乳酸， 并使用真菌纤维素良好地运作于纤维素的同步醣化和发酵（SSF)期间（21，22)。这种用于 凝结芽孢杆菌的发酵及真菌纤维素活性的最佳组合使得比较于嗜温细菌的生物催化剂的 同步醣化和发酵允许减少4倍的纤维素使用量（21)。对比于需要复合营养素的乳酸细菌， 凝结芽孢杆菌也以便宜的玉米浸渍液（corn steep liquor) (0.25%，w/v)补充剂于矿物盐 介质中成长并发酵糖（8,15,18)。虽然凝结芽孢杆菌在将纤维素转变成旋光性纯L型（+) 乳酸的生物催化剂上具有优异潜力，相同效力的用于制造乳酸的D型（-)异构物的微生物 目前仍未被讨论过。
技术实现思路
本专利技术提供一种设计并产生比较于亲代多肽（parent polypeptide)具有修改功 能的甘油脱氢酶（glycerol dehydrogenase, GlyDH)变体。本专利技术更提供一种编码比较于 亲代多肽具有修改功能的甘油脱氢酶多肽变体的核酸。本专利技术的各种实施形态中也提供一 种包含编码甘油脱氢酶变体的多核苷酸的宿主细胞与制造乳酸的方法。 【专利附图】【附图说明】 图1为葡萄糖与木糖在凝结芽孢杆菌菌株P4-102B中的无氧代谢途径。箭头的厚 度表示葡萄糖或木糖流到L-乳酸（折线）作为野生型无氧生长期间的优选路线和流到在 本研究中所建构的菌株QZ19的D-乳酸。虚线箭头（L-LDH和ALS)代表于本研究中引进的 二个途径的变异。在乳酸细菌中的木糖发酵途径，例如乳酸球菌利用磷酸乙酮醇酶途径导 致等摩尔乳酸和乙酸亦呈现作为比较。参考帕特尔等人透过凝结芽孢杆菌和乳酸球菌发酵 五碳醣的细节（17)。 图2D-乳酸生产凝结芽孢杆菌菌株QZ19的发酵分布曲线图。葡萄糖为进行发酵 在50°C下浓缩为110g ΓΗΟ.ΘΜ)且媒介通过添加氢氧化钙（Ca(0H)2)维持pH值为5.0。 图3为结晶纤维素通过凝结芽孢杆菌菌株QZ19在50°C、pH值5. 0下同步醣化和 发酵成D-乳酸。乳酸球菌资料是从欧等人（22)取得并包含作为比较。初始纤维素（过滤 禮：，Solka Floe)浓缩为 40g L、 图4为各种凝结芽孢杆菌菌株在往D-乳酸生产菌株QZ19的路径上的粗取物蛋白 质的聚丙烯酰胺胶体电泳（SDS-PAGE)。以pH控制（5.0)发酵的LB+葡萄糖中（30g Γ1)的 培养生长物在生长的中期到晚期指数相期间收获，且制备并分析细胞萃取物。左线，标准分 子量。左侧的数字代表蛋白质依千道尔吞的对应分子量。右线，菌株QZ19的纯甘油脱氢酶 (GlyDH*)〇 图OTNA插入于强化gldA表达的凝结芽孢杆菌菌株QZ13的gldA基因的上行区域 中。插入件DNA(1821bp)以斜体起始表示于gldA基因（在ATG中"A"作为+1)的-62处 的"C"後且持续往上行。直接重复（封闭于椭圆形内）的十一个底物表示插入的端点处，一 个位于插入件的5-端点处而第二个位于紧邻插入的3-端点处的gldA基因的5-端点处。 0RF1，为假定DoeR家族转录调节子；0RF2和0RF3,在插入件DNA中的假定转座酶；gldA，甘 油脱氢酶。表不假定-10、-35及沙恩-达尔加诺序列（Shine-Dalgarno sequences, SD)。 图6A、6B、6C凝结芽孢杆菌野生型P4-102B的发酵分布曲线图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种隔离的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脱氢酶的序列，其中苯丙氨酸被选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代，和/或天冬氨酸被选自谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述苯丙氨酸对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸，且所述天冬氨酸对应于序列号第3号的位置121。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆昭，基尔纳升·T尚穆根，朗尼欧尼尔·英格拉姆，
申请(专利权)人：美国佛罗里达大学研究基金会公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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