一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，首先，利用RT-PCR法扩增出了菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因(SAD)，连接该基因至植物遗传转化载体pBI121上；经核苷酸序列分析克隆并重组正确的载体转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中；含重组质粒的农杆菌以叶盘法转化烟草无菌苗外植体，筛选出卡那霉素抗性植株并移栽于花盆中，生长成熟后收集种子；种子播种于含卡那霉素的MS培养基上使其萌发生长；从卡那霉素抗性植株的叶片提取核DNA进行PCR检测、点杂交及Southern杂交鉴定；最后，以分子鉴定的阳性转基因烟草作为实验材料，在低温胁迫下，分别进行电导率测定和叶绿素含量测定，转SAD基因烟草的抗寒性有明显的改善。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于脂肪酸去饱和酶基因的抗寒转基因烟草的构建方法，其特征在于、包括以下步骤：(1)利用RT‑PCR法扩增出的菠菜硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因连接至植物遗传转化载体pBI121上；(2)将核苷酸序列测定正确的重组载体转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404中并鉴定阳性转化菌落；(3)将阳性转化子浸染烟草叶盘，形成愈伤组织并分化出芽后，在抗性MS培养基(含100mg/L Km，500mg/LCB)上进行诱导生根，待根长达数厘米时，移栽于盛有营养土的花盆中，在自然光下生长；提取卡那霉素抗性植株的叶片DNA进行点杂交及Southern杂交，确定SAD基因导入的烟草植株；(4)以SAD基因导入的转基因烟草作为实验材料，‑20℃冷冻40分钟后置于室温下，测定叶绿素含量随时间的变化；室温(27℃)下培养的转基因烟草移至6℃生长，测定电导率随时间的变化；以转SAD基因烟草的叶绿素含量和电导率变化判断转基因烟草的抗寒性是否有明显改善。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马建忠，刘丹，肖成斌，马燕林，王永刚，张伟杰，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62