治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的反义DNA序列及其应用。所述单链反义DNA序列是以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因部分序列作为靶点，设计并合成的20nt的反义DNA，不带有其他化学修饰。采用脂质体介导法转染猴肾上皮Marc-145细胞，能够显著抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖，通过荧光定量RT-PCR方法和间接免疫荧光实验方法检测，发现该反义DNA序列具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用。因此本发明专利技术的反义DNA序列在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的治疗和控制中具有广泛的应用前景，对基因治疗猪繁殖与呼吸综合征具有重要价值，所述反义DNA序列来源容易，成本低廉，具有极大的市场价值。

【技术实现步骤摘要】
治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用
本专利技术涉及用于治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染中的应用，特别是治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用。技术背景猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS)，又名蓝耳病，是世界范围内给养猪业造成巨大经济损失的重要传染病之一，由于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV)存在较大的遗传变异性，时常发生由于疫苗接种失败而使PRRSV再次成为原发性病原，给该病的预防和治疗带来很大困难。因此，如何有效地控制该病的流行是目前研究者和生产者面临的严峻挑战和重大课题。高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控制措施研究中的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致病的分子机制的深入认识，使得疫苗研究处于一个瓶颈时期，因此有必要建立另外一种新的抗病毒策略。反义核酸(antisenseoligonuleotides,AS-ONs)是指与靶DNA或RNA碱基互补,并能与之结合的一段DNA或RNA，一般AS-ONs长度为15～20碱基。1967年，Belikova等提出了利用一段反义寡核苷酸来特异性地抑制基因表达的设想。1978年，Paul等利用一段反义DNA寡聚核苷酸链成功地抑制了Rous肉瘤病毒的复制，引起人们极大地关注。20世纪80年代，寡核苷酸人工合成技术的成功，使反义核酸的研究迅速发展起来。目前，反义核酸技术作为一种有效的研究手段正被广泛地应用于功能基因组学和药物研发。目前普遍认为反义核酸可以在复制、转录、表达3个水平上发挥作用。其机制为:(1)在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA结合，从复制与转录水平发挥反义阻止作用，这种反义技术称为“反基因治疗”(Anti-genetherapy)；(2)与mRNA的5’末端的SD序列或核糖体结合位点结合,或与mRNA的SD序列上游的非编码区结合，改变mRNA的二级结构,阻碍核糖体的结合，从而阻碍翻译；(3)作用于mRNA的polyA形成位点,阻止成熟和转运；(4)作用于mRNA的5’末端，阻止帽子结构的形成；反义核酸与靶序列结合后激活某些酶如RNAseH，将靶序列降解。一种反义核酸究竟通过何种途径发挥抑制功能，取决于反义寡核苷酸的种类是DNA还是RNA，以及是否经过修饰等具体情况。鉴于PRRS对养猪业造成的严重危害，而以疫苗预防接种为主的防制措施存在着种种不足：如由于弱毒疫苗接种导致该病的爆发，在接种灭活疫苗猪群中爆发非典型PRRS流行等，使得人们对疫苗使用的安全性和效率提出了疑问。特异、高效的抗病毒药物在控制PRRS中的应用必然是全面控制PRRSV措施的一个良好补充。基于反义核酸在医学研究领域中的良好应用前景以及控制PRRS流行的紧迫性，特提出本项目研究的立项依据。本专利技术将针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5′-非编码区，NSP9和ORF7基因的正、负链序列，运用计算机软件设计反义寡核苷酸以靶细胞的体外培养为模型，旨在开发一种新的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物，并为最终应用于临床兽医领域奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列及其应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：1、用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列，其序列为下列序列中的任意一个或组合使用：YN-2：5’-ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3’YN-3：5’-CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3’YN-8:5’-TGCAGCATCCTCACAACCGT-3’2、本专利技术采用化学合成的反义DNA序列。3、本专利技术针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的5'-UTR，ORF5和NSP9基因的正、负链序列，设计多条反义DNA序列。通过显微镜观察不同处理组病毒所致细胞CPE的变化、荧光定量RT-PCR方法和间接免疫荧光等方法，从病毒mRNA和病毒蛋白水平，评价筛选所设计的反义DNA对PRRSV流行毒株增殖的影响。试验结果表明，本专利技术筛选出的反义DNA序列可抑制PRRSV在Marc-145细胞上的增殖；反义DNA在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征药物中的可能作用机制在于：在分子水平上，反义DNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒mRNA基因的表达，从而抑制病毒蛋白增殖与感染。本专利技术具有下述优点：1.目前尚无治疗PRRSV感染的特效药物，高效、安全的PRRS疫苗是目前蓝耳病控制措施研究中的一个焦点。但病毒的高频变异特性以及缺乏对PRRSV免疫逃逸机制及其致病分子机制的深入认识，使得疫苗研究处于了一个瓶颈时期，因此，寻找新的抗病毒策略，已成为目前猪蓝耳防制研究中的热点。反义DNA具有显著下调猪繁殖与呼吸综合征病毒核蛋白基因表达、抑制病毒增殖的作用，体外细胞药效实验显示具有确切的抗病毒效果。2.本专利技术是关于用于治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列。反义DNA序列可为感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪只提供新的治疗药物，具有剂量适中，费用适中，用药方便，疗效显著，毒副作用小等优点。附图说明图1本专利技术的反义DNA片段所针对PRRSV基因位点作用示意图。图2本专利技术的反义DNA片段抑制PRRSV在Marc-145细胞增殖效果示意图。图3本专利技术的反义DNA片段抑制PRRSVmRNA基因表达抑制示意图。图4本专利技术的反义DNA片段抑制PRRSV核蛋白表达示意图。具体实施方式以下结合附图1-4，用本专利技术的实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此来限定本专利技术。以下实施例中所使用的技术，包括基因测序、合成、细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、细胞系等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员通过公共途径获得。实施例1：反义DNA的设计反义DNA的设计策略：1)完整地预测mRNA的主要二级结构和次要二级结构，这些结构预测主要遵循自由能最小，不在折叠区。尽可能地找到单链区域、如果单链区域的长度不够，两端可以延伸到双链区域；2)反义核酸的长度要求20nt。一般选用起始密码子(AUG)或其附近的20个碱基序列，或是在mRNA的两端，或是颈环结构，尽可能在单链区域；3)尽量含有CCAC,TCCC,ACTC,GCCA或CTCT碱基，这些碱基有助于增强反义核酸作用；4)CG含量也有助于反义核酸发挥作用，控制G+C含量在40％至60％之间；5)选择RNA二级结构中不稳定的部位作为靶点，从而使反义核酸与靶位点牢固结合。根据PRRSV毒株参照序列与运用DNAStarLasergene7.1在NCBI上下载尽可能找到的(>100条)PRRSV毒株的5’-UTR端、ORF5、NSP9等基因进行分析，找出共有保守区，以保守区域正链和负链为靶序列，然后使用RNA二级结构分析软件RNAStructure5.3对PRRSV流行毒株的5’-UTR、ORF5、NSP9三个区域进行二级结构预测及OverallΔG37.0、Breaktarg.ΔG37本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的反义DNA序列，其特征在于，核酸序列为下列序列中的任意一个或组合使用：YN‑2：5’‑ATTTGACGCTATGTGAGCTG‑3’YN‑3：5’‑CAGCTCACATAGCGTCAAAT‑3’YN‑8：5’‑TGCAGCATCCTCACAACCGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种治疗和预防猪繁殖与呼吸综合征的药物，包含下列序列中的任意一个所示的反义DNA或其组合：YN-2：5’-ATTTGACGCTATGTGAGCTG-3’；YN-3：5’-CAGCTCACATAGCGTCAAAT-3’；和YN-8：5’-TGCAGCATCCTCACAACCGT-3’。2.反义DNA在制备用于治疗和/或预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的用途，所述反义DNA选自下列序列中...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹革芬，毕峻龙，李文贵，李想，郑龙龙，杨贵树，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53