一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的液相色谱方法，步骤包括：a.选用色谱柱规格为4.6×250mmi.d,5μm的watersC18柱；b.以15%甲醇-85%磷酸盐溶液为流动相，流动相流速为0.9mL/min，待测样品经2%的高氯酸去蛋白后，采用超声提取，离心后调节pH为6.0，取30微升上清液直接进样测定，外标法定量；c.利用二极管阵列检测器对三种芳香族氨基酸的进行检测，一次进样可以同时得到这三种芳香族氨基酸的全波段扫描图谱，采集到三种氨基酸在每一个瞬间的光谱图，直观地鉴定色谱峰的纯度，对比标准品和待测样品的全波段扫描图谱进行定性。本发明专利技术操作简便、灵敏度高，定性准确。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的液相色谱方法，步骤包括：a.选用色谱柱规格为4.6×250mmi.d,5μm的watersC18柱；b.以15%甲醇-85%磷酸盐溶液为流动相，流动相流速为0.9mL/min，待测样品经2%的高氯酸去蛋白后，采用超声提取，离心后调节pH为6.0，取30微升上清液直接进样测定，外标法定量；c.利用二极管阵列检测器对三种芳香族氨基酸的进行检测，一次进样可以同时得到这三种芳香族氨基酸的全波段扫描图谱，采集到三种氨基酸在每一个瞬间的光谱图，直观地鉴定色谱峰的纯度，对比标准品和待测样品的全波段扫描图谱进行定性。本专利技术操作简便、灵敏度高，定性准确。【专利说明】
本专利技术属于分析化学领域，涉及检测三种芳香族氨基酸的方法，特别涉及用高效液相色谱法一二极管阵列法同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的方法。
技术介绍
芳香族氨基酸为含有芳香环侧链的氨基酸,包括苯丙氨酸(Phenylalanine, Phe)>酪氨酸(Tyrosine, Tyr)、色氨酸(Tryptophane, Trp)等三种氨基酸,其中Phe和Trp属于必需氨基酸，Tyr则属于半必需氨基酸。芳香族氨基酸在肝、肾、神经等疾病诊断中有很重要的作用，且它们对水产食品的营养风味也有重要的贡献。因此，准确测定芳香族氨基酸在蛋白质化学研究中有非常重要的意义。 目前国内外测定芳香族氨基酸的方法主要有高效液相色谱法、荧光分光光度计法、毛细管电泳法、质谱法等。如:陶玉贵等用毛细管电泳法测定发酵液中L-色氨酸的含量(食品与发酵工业，2008，34 (9):140-143)，唐爱国专利技术了一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清中芳香族氨基酸含量的方法(专利号:CN 102128893 A)，陈舜胜等用HPLC法快速测水产品中游离芳香族氨基酸含量的研究(上海海洋大学学报2013，22 (4):629-633)等；其中以HPLC衍生法为主，因其灵敏度高、设备要求适中以及操作简便。由于Phe、Tyr及Trp的荧光特性不一致，用荧光分光光度计法不能在同一波长下同时对其测定；毛细管电泳法和质谱法的分辨率较高，但也有仪器昂贵、重复性较差等不足之处。 本专利技术利用Tyr、Phe和Trp含有不饱和共轭环状结构，可用二极管阵列检测器(Photo D1dearray, PDA)对被测物质进行测定并全波长扫描,一次进样可以得到三种芳香族氨基酸的全波段扫描图谱，包括三种芳香族氨基酸各自的最大吸收波长进行检测，比常规紫外可见吸收检测器的灵敏度更高，定量更准确。由于PDA检测器具备随峰快速扫描的特性，在色谱分析同时能够采集色谱流出物在每一个瞬间的光谱图，因而可以直观地鉴定色谱峰的纯度，从而对检测数据作出合理取舍，保证结果更准确，定性更可靠。
技术实现思路
本专利技术目的是针对以上现有技术的前处理复杂、灵敏度低、回收率不高、定性不准确等不足，提供一种操作简单，灵敏度高、分离速度快且定量定性准确，能够同时测定水产品中三种芳香族氨基酸的HPLC-PDA法，为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:一种用高效液相色谱一二极管阵列检测器同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的方法，包括以下步骤:流动相为A:B = 15:85，A为甲醇溶液，B为0.05 mol/L磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至6.0 ;等度洗脱；流速:0.9 mL/min ;进样量为30微升；柱温为40°C。 流动相使用前用0.45 μ m的水相微孔滤膜过滤后，超声脱气10分钟。 色谱柱选用Waters Atlantis T3 C18 (4.6 X 250mm, 5 μ m)作为色谱固定相。 用二极管阵列检测器扫描确定检测三种氨基酸的最佳检测波长,确定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长分别为274.5nm、256.7nm和279.3nm。 Tyr、Phe和Trp的标准溶液是用2%的高氯酸溶液溶解、混匀；分别配制浓度1000 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL。 用2%的高氯酸溶液提取三种芳香族氨基酸。 制作标准工作曲线，定性定量方法、评价精密度和考察回收率。 本专利技术的优选技术方案为:配制流动相，由15%的甲醇和85%磷酸盐溶液组成，磷酸盐溶液由0.05 mol/L磷酸二氢钾及磷酸二氢钾(1:1)组成，PH范围为6.0?6.3。因采用15%的甲醇和85%磷酸盐溶液分离出的三种待测氨基酸峰型好，且柱压也不高，分离速度快、效率高；PH范围为6.0? 6.3对三种氨基酸的分离效果好。 以规格为4.6X250_ 1.d, 5 μ m的waters C18色谱柱为固定相。 用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液。 取新鲜水产品肉，用2%的高氯酸溶液匀浆、超声、离心提取，采用2%的高氯酸溶液作为提取剂，对提取水产品中的三种氨基酸回收率高，特别对色氨酸提取效果好。 设置流动相流速为1.0mL/min,进样量为30微升。 将芳香族氨基酸经色谱柱分离后，用二极管阵列检测器进行分析，选择Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长进行测定。 通过外标法进行定量，并通过对比样品和标准品中三种芳香族氨基酸的全波段色谱扫描图谱的相似程度，鉴定色谱峰的纯度。 流动相的具体配制方案为:调节流动相中的磷酸盐溶液pH为6.0,甲醇和磷酸盐溶液使用前用0.45 μ m的微孔滤膜过滤,超声脱气lOmin。 标准溶液的具体配制方案为:用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液，使Phe、Tyr及Trp的浓度分别为1000 μ g/mL,500 μ g/mL,250 μ g/mL,并用2%的高氯酸溶液将氨基酸标准混合储备液依次稀释2、5、10、20、50倍。 样品前处理的具体方案为:取新鲜水产品肉5.0g于离心管中，加入1mL预冷5%的高氯酸勻衆2min,用玻璃棒搅拌均勻，超声提取5min后,在冷冻离心机4°C下1000rpm离心20min，取上清液过滤，过滤后所剩的沉淀物加入预冷的2% PCA溶液再进行浸提、离心，重复2次后合并上清液。用KOH溶液中和上清液至pH为6.0。中和时先加5mol/L的KOH溶液调节，待接近至所需pH=6.0时，改用lmol/L的KOH溶液调节。 芳香族氨基酸经Waters Atlantis T3 C18分离后，进入二极管阵列检测器检测，Tyr、Phe及Trp三种物质的检测波长设定分别为274.5,256.7和279.3nm。 本专利技术的创新在于可以同时测定水产品中芳香族氨基酸含量，且本方法具有操作简便、灵敏度高、无需柱前衍生等优点。 本专利技术巧妙利用芳香族氨基酸含有不饱和共轭环状结构，建立了一种同时测定水产品中芳香族氨基酸含量的HPLC-PAD法。水产品去蛋白后取上清液直接进样，Tyr、Phe和Trp通过色谱柱分离后，采用PAD检测器进行检测，本专利技术明显优于已公开的技术，操作快速、简便、灵敏度高，又能达到同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的要求，因此是一项非常值得广泛应用和推广的技术。 【专利附图】【附图说明】 图1为Tyr、Phe及Trp的紫外210?40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1） 配制流动相，由15%的甲醇和85%磷酸盐溶液组成，磷酸盐溶液由0.05 mol/L磷酸二氢钾及磷酸氢二钾（1：1）组成，pH范围为6.0～6.3； （2）以规格为4.6×250mm i.d, 5μm的waters C18色谱柱为固定相，i.d为内径； （3）用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液；（4）取新鲜水产品肉，用2%的高氯酸匀浆、超声、离心提取；（5）设置流动相流速为1.0mL/min，进样量为30微升；（6）将芳香族氨基酸经色谱柱分离后，用二极管阵列检测器进行分析，选择Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长进行测定；（7）通过外标法进行定量，以标准品峰面积与浓度做标准曲线，待测样品进样后可得到样品峰面积，通过标准曲线可计算出样品浓度；并通过对比样品和标准品中三种芳香族氨基酸的全波段色谱扫描图谱的相似程度，鉴定色谱峰的纯度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢晶，邱伟强，王金锋，杨胜平，叶藻，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31