铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法。本发明专利技术要解决的技术问题是现有的处于研发及临床试验阶段铜绿假单胞菌疫苗保护效力低，对机体的毒性大，难以治愈感染而不能满足临床免疫需求的问题。本发明专利技术解决上述问题的技术方案是提供一种新型疫苗的制备方法。该方法包括以下步骤：首先获取铜绿假单胞菌菌体，然后射线辐照细菌得到铜绿假单胞菌疫苗。本发明专利技术提供的疫苗不仅用来预防疾病，也可以应用与治疗疾病，具有好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法
本专利技术是涉及生物
，具体涉及一种细菌疫苗及其制备方法。技术背景铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，其对外界各种环境及灭活措施抵抗力较强，尤其在潮湿的环境中可长期生存。土壤、水、空气、人和动物的皮肤、粘膜、肠道及上呼吸道等多处都有该菌存在。其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力降低下的病人，如大面积烧伤，长期使用免疫抑制剂、肿瘤、低蛋白血症患者等。铜绿假单胞菌引起的感染可发生在人体任何部位，临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等。据近年的调查报告，院内感染中30％以上都是由铜绿假单胞菌引起的。对于铜绿假单胞菌引起的感染主要靠药物治疗，而近些年抗生素的广泛应用产生了大量的耐药菌株进一步加剧了铜绿假单胞菌对患者的威胁。目前已经研究成熟的铜绿假单胞菌对抗生素的耐药机制包括以下几方面：①细菌外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位；②铜绿假单胞菌细胞通过主动外排过程，可将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外；③改变抗生素的作用靶点青霉素结合蛋白(PBPs)的数量或结构，以降低药物与PBPs的亲和力，从而产生固有耐药；④质粒或染色体介导的beta-内酰胺酶使抗生素失活。所以目前铜绿假单胞菌的感染已经到了无抗生素可用的阶段，通过免疫方式预防及控制铜绿假单胞菌感染已是大势所趋。疫苗是一种能刺激机体免疫系统，活化T和B淋巴细胞产生特异性针对靶抗原(病毒、细菌等)的抗体或者免疫细胞的物质。经典的疫苗起源于抗感染免疫，即采用处理过的病原微生物，特别是细菌及其衍生物作为抗原，促使机体产生体液免疫反应以预防感染性疾病。目前全世界研究的铜绿假单胞菌疫苗制备方式已经涉及多个技术层面，如热或者甲醛处理的死菌疫苗，减毒疫苗，亚单位疫苗，单一组分(菌毛、鞭毛、外膜蛋白OprI/OprF等)疫苗等。在基础实验中，单一组分疫苗得了较好的预防效果，但由于抗原成分单一，只能针对单一的疾病(如肺炎等)的感染。灭活(热、甲醛等)或者减毒(基因突变)的全菌体疫苗抗病谱相对扩大，但由于制备过程某些未知抗原成分的灭活，细菌代谢活性降低，造成免疫原性及预防效果较差，且由于灭活不彻底，造成疫苗残留毒性较大。关于全菌体疫苗的研发已经在众多种属细菌(志贺菌，淋球菌，脑膜炎双球菌等)中实施，但这些疫苗均已失败而告终，可想而知制成有效的全菌体疫苗是非常困难的，而目前研制的铜绿假单胞菌疫苗也依旧存在较大的局限性。理想的铜绿假单胞菌疫苗是尽可能的包括所有潜在致病抗原成分，对机体无潜在威胁毒性，能够针对不同血清型品种均有较好预防效果的低毒性全菌体疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有的全菌体疫苗保护效力低，对机体的毒性大，难以治愈感染而不能满足临床免疫需求的问题，提供的一种新的铜绿假单胞菌全菌体疫苗及其制备方法。本专利技术解决上述技术问题的技术方案是提供一种铜绿假单胞菌疫苗的制备方法。该方法包括以下步骤；首先获取铜绿假单胞菌菌体；然后射线辐照细菌得到铜绿假单胞菌细菌疫苗。其中，上述方法中所获取的细菌菌体是处于对数生长期的细菌菌体。进一步的，上述方法包括以下步骤：(1).获取用于制备疫苗的铜绿假单胞菌细菌株；(2).增殖细菌：将步骤(1)获取的细菌株接种在适宜培养基中培养，使细菌处于对数增长期；(3).收集菌体：收集步骤(2)得到的含有菌体及基质成分的培养基，离心并收集离心沉淀物；(4).射线处理：将上述净化处理的离心沉淀物重悬成细菌悬液，移至非金属容器中，用射线辐照细菌悬液；(5).调节菌体浓度：将步骤(4)得到的射线辐照后的细菌悬液再次重悬，调节为最终使用目标细菌浓度，即得到铜绿假单胞菌疫苗优选的，上述方法在第(4)步射线处理前或者后，还进行纯化菌体的步骤。纯化菌体是为了去除有培养基及相应细菌胞外分泌物。纯化步骤可以使用各种不引起机体过敏反应的溶剂进行洗涤。优选方案为无菌生理盐水或者PBS洗涤。集菌纯化步骤也以使用如浓缩、过柱收集法等本领域常用方法。其中，上述方法中所述的射线辐照为使细菌失去增殖活性且代谢活性保留。其中，上述方法中所述的所述细菌失去增殖活性是指在适宜培养基上培养24-48小时，无菌落产生；所述代谢活性保留是指用细胞活性检测试剂检测其代谢活性与未接受过辐照的对照组细菌相比不低于正常活性的50％。一般使用辐照后代谢活性为与未接受过辐照的对照组细菌相比的50％-70％的铜绿假单胞菌。其中，上述方法中所述的射线辐照所使用的射线为X射线、gamma射线或同位素放射源Co60产生的射线。其中，上述方法中所述的射线辐照的总剂量为：3300-3500Gy。优选的剂量为3400Gy。其中，上述方法中射线辐照的方式为低剂量，长时间，间断照射。其中，上述方法中射线辐照的方式为每照射20-25分钟，停止4-5分钟，进行循环照射：剂量为8-9Gy/min，照射6.2-7.3小时。本专利技术还提供了一种由上述方法制备的细菌疫苗。进一步的，上述细菌疫苗，还含有免疫佐剂。其中，上述细菌疫苗的剂型为皮下注射制剂、肌注注射制剂、口服或鼻腔吸入制剂等常用的剂型。同时，本专利技术还提供了上述的细菌疫苗在制备治疗铜绿假单胞菌引起的感染性疾病的药物中的用途。其中，上述铜绿假单胞菌引起的感染性疾病包括肺炎、败血症、角膜炎、皮肤软组织感染等中的至少一种。本专利技术提供的铜绿假单胞菌疫苗由经射线辐照处理的铜绿假单胞菌全菌体组成。且射线辐照处理使细菌丧失增殖能力，但仍保留代谢活性，因此保留了绝大部分免疫原性，机体可针对免疫原刺激产生强有效的免疫反应，即足够的体液及细胞免疫预防及治疗由铜绿假单胞菌引起的感染，同时也有足够的安全性。本专利技术提供的疫苗制备方法不仅用来预防疾病，也可以应用与治疗疾病。具体而言，针对正常的动物或者人体，使用本专利制备的疫苗可以增强机体的预防和抗病能力，达到预防疾病的目的；对于患有相应疾病或者感染的动物和人体，本疫苗可以诱导机体产生特定的针对致病因素的反应，快速有效的消灭病原体，达到治疗疾病和病患的目的。本专利技术的有益效果在于：该疫苗是一种全菌体灭毒疫苗，但是保留了分泌细胞外基质及毒性分子的能力，最大程度的保留并发挥了铜绿假单胞菌的抗原特性，可以激发机体的固有免疫及适应性免疫应答机制，增强机体的免疫反应，产生足够的抗体及细胞免疫分子对抗潜在的感染病菌。同时也具有足够的安全性。附图说明图1、疫苗制备流程示意图。图2、射线处理后细菌增殖能力变化图(1拉德＝0.01戈瑞Gy)。图3、射线处理后细菌代谢活性变化图。图4、小鼠免疫后生存保护效果图(5×107激发)。图5、小鼠免疫后生存保护效果图(108激发)。图6、小鼠免疫后中性粒细胞募集比例图。具体实施方式本专利技术提供的铜绿假单胞菌疫苗由经射线辐照处理的铜绿假单胞菌全菌体组成。且射线辐照处理使细菌丧失增殖能力，但仍保留代谢活性，因此保留了绝大部分免疫原性，机体可针对免疫原刺激产生强有效的免疫反应，即足够的体液及细胞免疫预防及治疗由铜绿假单胞菌引起的感染。同时也具有足够的安全性。具体而言，要首先培养获取的铜绿假单胞菌样品，反复离心纯化后重悬调节菌体浓度至1010/ml，此疫苗悬液接受低剂量长时本文档来自技高网...

【技术保护点】
铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征包括以下步骤；首先获取铜绿假单胞菌菌体；然后接受射线辐照得到细菌疫苗。

【技术特征摘要】
2014.06.27 CN 201410299010.X1.铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1).获取用于制备疫苗的铜绿假单胞菌细菌株；(2).增殖细菌：将步骤(1)获取的细菌株接种在适宜培养基中培养，使细菌处于对数增长期；(3).收集菌体：收集步骤(2)得到的含有菌体及基质成分的培养基，离心并收集离心沉淀物；(4).射线处理：将上述净化处理的离心沉淀物重悬成细菌悬液，使细菌达到约1011个菌体数，移至非金属容器中，用射线辐照细菌悬液；所述的射线辐照使用的射线为X射线、gamma射线或同位素放射源Co60产生的射线；所述的射线辐照的总剂量为：3300-3500Gy；所述的射线辐照的方式为每照射20-25分钟，停止4-5分钟，进行循环照射；剂量为8-9Gy/min，照射6.2-7.3小时；(5).调节菌体浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏于全，李燕燕，王震玲，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51