本发明专利技术公开了一种可视化检测核酸恒温扩增的方法和反应装置，包括：在特定的密闭反应装置中事先将能够将焦磷酸分解为磷酸的试剂添加在核酸扩增反应液当中。待反应结束后。在不开盖的情况下。通过将核酸扩增反应液与已预先另存于装置其他选定显色试剂混合反应。观测混合物进一步反应后的颜色。实现对样品是否发生核酸扩增反应作出判断。其中选定显色试剂为能与磷酸(根)发生颜色反应的试剂组合。本发明专利技术方法操作简单，快速灵敏，测试结果通过肉眼即可检测，成本低廉，弥补了现有检测核酸扩增技术的不足。
【技术实现步骤摘要】
可视化检测核酸恒温扩增的反应装置及方法
本专利技术属化学分析、核酸分析领域，尤其涉及一种可视化检测核酸等温扩增产物的反应装置和方法。
技术介绍
随着生物技术的发展，核酸恒温扩增技术作为新型的核酸扩增技术被广泛应用在农业、医学及食品工业领域。目前常用的恒温扩增技术有交叉引物恒温扩增技术（CPA）、环介导恒温扩增技术（LAMP）、链置换扩增（SDA）、依赖解旋酶的扩增（HDA）。由于该类新型扩增技术能够在较低的恒定温度条件下实现核酸扩增（大部分恒温扩增技术所需反应温度在60℃或者37℃左右），因此摆脱了传统PCR所需要的精密的温控设备，大大缩小成本，受到广泛关注。用于核酸恒温扩增产物检测的方法，目前主要有电泳、荧光染料、浊度、免疫试纸条等。其中，凝胶电泳法需要有开盖的操作，因此容易造成气溶胶污染，并且需要用到高致癌性的荧光染料危害人体健康；荧光法检测需要特殊、庞大、昂贵的光学仪器；而浊度法虽然能能够使用肉眼观测，但是对核酸扩增效率要求较高，要求核酸扩增产量达到最低肉眼可见浊度并且容易受到主观因素的影响，并不适用于所有的恒温扩增检测。因此，该领域需要开发新的核酸扩增产物检测方法。可视化检测具有简单、直接、便于大通量筛查的特点，可以摆脱复杂的仪器设施，对检测结果做出判断。目前有钙黄绿素荧光目视法，HNB法。这两种方法是利用金属指示剂间接或是直接地检测反应体系中的金属离子浓度，从而发生颜色变化，具体来讲，分别是从橘色变为绿色或是从紫色变为天蓝色。因此，目前可视化检测核酸扩增的方法具有不可避免的缺点：1.金属指示剂容易受到样品中其他金属离子的影响，造成误差；2.阳性反应结果是从一种颜色到另外一种颜色，不利于肉眼观察；3.检测对象是反应液中初始浓度较高的金属离子，因此会具有较高的背景信号降低检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是提供一种可视化检测核酸恒温扩增的反应装置，可实现在不打开盖的情况下，使得核酸恒温扩增反应能够不受干扰地进行，之后进行的检测反应能够按序正常进行。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置，包括反应容器，其特征在于所述反应容器具备多个相互独立但是连通的储液区域，其中一个区域用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂（以下简称为产物检测试剂），所述反应装置具有所述反应容器的盖，以保持密封性。本专利技术反应装置的独立、分隔但连通的储液区域保证核酸恒温扩增反应液和产物检测试剂在反应前相互独立、互不干扰地盛放在装置的不同区域；在不开盖的情况下，通过剧烈摇晃或是震动、颠倒等操作下，不同区域预存储的液体才混合均匀用于可视化检测。进一步地，所述反应容器为多个试管并列连为一体的试管组，试管组中试管的上部连通；试管在连通部位以下的区域为所述储液区域。所述用于进行核酸恒温扩增反应的储液区域的容积小于等于80ul大于等于10ul。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂中的不同试剂在检测反应前放在不同的储液区域中，所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂总体积优选地在90~450ul之间，更优选地在，90~270ul之间。所述多个能区分但是连通的储液区域的数量，优选为2-5个，更优选地为2-4个。本专利技术另一个目的是提供一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。为此，本专利技术采用以下技术方案：其采用上述的反应装置作为核酸恒温扩增反应及用于可视化检测恒温扩增结果的反应的反应器；所述方法利用所述反应装置提供的封闭的反应器中用于核酸恒温扩增反应的储液空间进行核酸恒温扩增反应，并将进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂一一预先储放在所述反应器中的其它储液区域中，进行核酸恒温扩增反应的反应液中含有将焦磷酸根分解为磷酸根的试剂，所述进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂是指能与磷酸根进行反应的显色试剂；在核酸恒温扩增反应过程中，核酸扩增副产物焦磷酸根被分解为磷酸根，核酸恒温扩增反应结束后，在依旧封闭反应器的情况下，将反应器内的所有液体混匀，观察反应器内是否发生颜色变化，根据反应器内的液体颜色是否符合显色试剂与磷酸根发生反应后应当体现的颜色来对核酸恒温扩增进行可视化检测。所述核酸恒温扩增反应试剂包含核酸恒温扩增反应混合液和无机焦磷酸酶；其中核酸恒温扩增反应混合液可以来自于商业化核酸恒温扩增试剂盒，例如广州迪澳PA101Nos基因核酸检测试剂盒；无机焦磷酸酶是可以将焦磷酸水解生成磷酸根的酶，优选为耐热型的无机焦磷酸酶。所述核酸恒温扩增反应可以为扩增温度低于90°C的扩增反应，可以为交叉引物恒温扩增（CPA），也可以是环介导恒温扩增（LAMP）。所述恒温扩增反应可以在水浴、金属浴或其他加热条件下进行。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂中的不同试剂在反应前放在不同的储液区域中，总体积优选地在90~450ul之间，更优选地在，90~270ul之间。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂可以是还原剂溶液和钼酸盐-酒石酸锑钾酸性溶液组合（组合一），或者钼酸盐酸性溶液和孔雀石绿溶液组合（组合二），总的体积在上述体积范围之内，有需要可以用水或是Tris-HCl缓冲液补充。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐溶液的配置可使用钼酸铵或钼酸钠，优选钼酸铵。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，酸为纯硫酸、硝酸，优选地为浓硫酸。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，还原剂溶液是由抗坏血酸或氯化亚锡配置，优选为抗坏血酸。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，抗坏血酸溶液中抗坏血酸的含量为0.2~1mg，优选地0.2~0.8mg，更优地0.2~0.6mg。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐-酒石酸锑钾溶液中钼酸铵的含量为0.1~0.5mg，优选地0.1~0.4mg，更优地0.1~0.3mg；酒石酸钾锑的含量为2.67~13.35ng，优选地2.67~10.68ng、更优地2.67~8.01ng；硫酸的含量为1.96g~9.8g，优选地1.96g~7.84g、更优地1.96g~5.88g。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐酸溶液中钼酸铵的含量为0.58mg~2.9mg，优选地0.58mg~2.32mg，更优地0.58mg~1.74mg；硫酸的含量为8.82mg~44.1mg，优选地8.82mg~35.28mg，更优地8.82mg~26.46mg。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，孔雀石绿溶液中孔雀石绿的含量为4.635ng~23.175ng，优选地4.635ng~18.54ng，更优地4.635ng~13.905ng。由上述技术方案可知，本专利技术还可形成一种专用于可视化检测核酸恒温扩增的试剂装置，其包括上述反应装置，反应装置中的用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂的总体积在90~450ul之间，用于进行核酸恒温扩增反应的储液区域的容积小于等于80ul大于等于10ul，其各项试剂的组合及含量如前所述。本专利技术与现有技术相比，本专利技术提供了一种既能符合核酸等温扩增反应条件又能符合生产磷酸根反应和磷酸根检测反应条件的反应装置可以实现在不打开反应容器的条件下，通过对不同溶液混合，检测核酸扩增反应过程中磷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置，包括反应容器，其特征在于所述反应容器具备多个相互独立但是连通的储液区域，其中一个区域用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂，所述反应装置具有所述反应容器的盖，以保持密封性。
【技术特征摘要】
1.一种可视化检测核酸恒温扩增的方法，其特征在于：其采用以下反应装置作为核酸恒温扩增反应及用于可视化检测恒温扩增结果的反应的反应器：所述反应装置，包括反应容器，所述反应容器具备多个相互独立但是连通的储液区域，其中一个区域用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂，所述反应装置具有所述反应容器的盖，以保持密封性；所述方法利用所述反应装置提供的封闭的反应器中用于核酸恒温扩增反应的储液空间进行核酸恒温扩增反应，并将进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂一一预先储放在所述反应器中的其它储液区域中，进行核酸恒温扩增反应的反应液中含有将焦磷酸根分解为磷酸根的试剂，所述进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂是指能与磷酸根进行反应的显色试剂；在核酸恒温扩增反应过程中，核酸扩增副产物焦磷酸根被分解为磷酸根，核酸恒温扩增反应结束后，在依旧封闭反应器的情况下，将反应器内的所有液体混匀，观察反应器内是否发生颜色变化，根据反应器内的液体颜色是否符合显色试剂与磷酸根发生反应后应当体现的颜色来对核酸恒温扩增进行可视化检测。2.如权利要求1所述的一种可视化检测核酸恒温扩增的方法，其特征在于：所述核酸恒温扩增反应试剂包含核酸恒温扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，张芳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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