鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用，属于动物病毒分子生物学技术领域。本发明专利技术通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的抑制肽，其氨基酸序列为：LLADTTHHRPWT。试验证明，鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度下均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，可用于制备抗鸭肝炎病毒病药物或饲料添加剂，在DHV-1的防治中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用，属于动物病毒分子生物学
。本专利技术通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的抑制肽，其氨基酸序列为：LLADTTHHRPWT。试验证明，鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度下均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，可用于制备抗鸭肝炎病毒病药物或饲料添加剂，在DHV-1的防治中具有良好的应用前景。【专利说明】鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用
本专利技术涉及一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，同时还涉及该抑制肽的应用，属 于动物病毒分子生物学
。
技术介绍
鸭病毒性肝炎，又称"背脖病"，是由鸭肝炎病毒（DHV)引起雏鸭肝脏损伤的一种 急性、高致病性传染病，其特征为发病急、传播快、死亡率高，临床表现为病鸭精神沉郁，出 现神经症状，运动失调，呈角弓反张，主要病理变化为肝炎和出血。鸭病毒性肝炎最先在美 国发现，并用鸡胚分离到病毒，之后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现。我国大 部分省市和地区亦有该病的发生。鸭病毒性肝炎主要通过接触传播，经呼吸道亦可感染，据 推测不发生与蛋的传递。该病主要发生在3周龄以下的雏鸭，尤其对1周龄的雏鸭具有极 强的致死性，病死率高达95%，且一年四季均可发生，并呈现不断上升的趋势，已对养鸭业 造成巨大的经济损失，严重制约了养鸭业的发展。 鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV)在分类上属微RNA病毒科，长20? 40nm，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH>3.0均有抵抗力，对热敏感，62°C 30min即被灭活， 大多数消毒药如福尔马林、氢氧化钠、漂白粉均可使其灭活。病毒在低温环境中能较长时间 存活，在4°C条件下可存活2年以上，在-20°C则可长达9年。通常将DHV分为3个血清型， 即1型（DHV-1)、2型（DHV-2)和3型（DHV-3)，其中DHV-1呈世界性分布。在我国，自1958 年发生鸭病毒性肝炎至2001年，DHV的血清型均为1型。但近几年来，国内外不少学者已 从发病鸭群中分离得到新型DHV-1毒株，新型DHV-1与以往分离的DHV-1在序列上存在显 著差异，且新型DHV-1均不与DHV-1产生交叉反应。为了更清楚地区分上述DHV-1毒株，国 内学者根据进化分析结果将1型鸭肝炎病毒分为3个基因型（A、B和C型），分别对应于以 往分离的血清1型、台湾新型和韩国新型。 近年来，我国已有多例DHV-Ι的报道。DHV-Ι作为小RNA病毒科成员，其衣壳蛋白 VP1是主要的保护性蛋白，编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，同时具有 与细胞受体结合的功能，是病毒感染细胞的关键，也是研究病毒与宿主细胞相互作用的首 选蛋白。 噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，由 于其具有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，近年来被广泛应用于肽类药物、抑制肽、抗 原模拟表位的筛选等研究领域。因此，利用噬菌体展示技术筛选DHV-1VP1蛋白特异性结合 的多肽，并研究该多肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响。可为DHV-1的防治提 供一个新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽。 同时，本专利技术还提供一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用。 为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是： 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 所述鸭肝炎病毒I型为基因 C型鸭肝炎病毒I型。 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用，具体为VP1蛋白抑制肽在制备抗鸭肝炎 病毒病（抑制鸭肝炎病毒增殖，如抑制鸭肝炎病毒I型在鸭胚成纤维细胞增殖）的药物或 饲料添加剂中的应用。 本专利技术的有益效果： 本专利技术通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标， 利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的抑制肽，其氨基酸序列为： LLADTTHHRPWT，可抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖。荧光定量PCR和TCID50检测VP1 抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响，结果显示，不同浓度的抑制肽（0. 02 μ g/ mL、0. 2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝 数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度。结果表明，鸭肝炎病毒I型VP1 蛋白抑制肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在DHV-1的防治中具有良好的应用前 旦 -5^ 〇 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中VP1基因的PCR扩增及重组表达质粒pET32a-VPl的鉴 定图谱； 图2为实施例1中重组VP1蛋白SDS-PAGE电泳及Western-blot分析； 图3为实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性； 图4为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果； 图5为试验例中DHV-1VP1蛋白抑制肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响； 图6为试验例中抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响（Real time PCR); 图7为试验例中抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响（TCID50)。 【具体实施方式】 下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。 实施例1 本实施例中鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的筛选，包括以下步骤： (l)DHV-lVPl 蛋白的制备 1)表达载体pET32a_VPl的构建 根据GenBank发表的DHV-1的VP1基因序列（序列号：EF653378)，利用DNAStar软 件分析，设计一对特异性引物，引物F15'端引入EcoR I限制性酶切位点，F25'端引入Xba I限制性酶切位点。引物由大连宝生物工程公司合成。 引物序列如下： Fl:5,-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3'（如 SEQ ID N0:2 所示）； F2:5, -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3'（如 SEQ ID NO. 3)。 鸭肝炎病毒I型VJ株已知从发病鸭场分离，通过序列测定和进化分析，确定为I 型鸭肝炎病毒，其基因型为C型（序列号：EF653378)。参照病毒RNA提取试剂盒（南京 Tiangen有限公司）操作步骤，常规方法提取VJ-DHV-1株RNA，通过常规反转录PCR获取 VP1蛋白的基因全长序列（Invitrogen-步法RT-PCR试剂盒）。将获取的VP1基因克隆 入PMD18-T载体并进行序列测定，将pMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载 体，构建重组表达质粒pET32a-VPl，并用EcoR I与Xba I双酶切和P本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王臣，何雷，李小康，牛明媚，张春杰，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41