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基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用技术

技术编号:10734500 阅读:124 留言:0更新日期:2014-12-10 11:10
本发明专利技术属于蛋白质工程和基因克隆技术领域,具体为一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法及其应用。具体步骤如下:(1)构建DNA重组酶的表达载体;(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性;(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA时生成的5’单链突出端长度,(4)验证制备的DNA重组酶生成5’单链DNA突出端的长度和基因克隆效率。本发明专利技术的有益效果在于:其制备的5’单链突出端的长度可控,维持在15-25个核苷酸范围内,使得克隆效率和准确率达到最高,利用中等效率的感受态细胞即可满足克隆要求。制备的DNA重组酶可用于基因克隆、点突变等基因工程领域。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于可控型DNA聚合酶和外切酶活性的DNA重组酶的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:(1)构建DNA重组酶的表达载体选取同时具有DNA聚合酶和3’外切酶活性的DNA聚合酶作为DNA重组酶原型,利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS表达原型重组酶,镍柱亲和纯化得到DNA重组酶,测定其DNA聚合酶和3’外切酶活性,计算原型DNA重组酶的3’外切酶活性和DNA聚合酶活性的比值,即E/P值,作为改善型DNA重组酶的筛选参数;(2)改造DNA重组酶的DNA聚合酶和3’外切酶活性在原型DNA重组酶基础上,利用基因点突变技术改变原型DNA重组酶负责DNA聚合酶和3’外切酶活性的氨基酸残基,调整DNA重组酶的E/P值,设计制备一系列DNA重组酶突变体;利用原核表达系统pET28a/BL21(DE3)pLysS重组表达、镍柱亲和纯化得到一系列DNA重组酶突变体,测定突变体的DNA聚合酶和3’外切酶活性、计算各突变体的E/P值,以原型DNA重组酶为参照物,筛选E/P值增高的一系列DNA重组酶突变体;(3)测定DNA重组酶突变体水解双链DNA产生的5’单链DNA长度人工合成长度为80个碱基对的双链DNA,以其作为底物,测定DNA重组酶突变体水解双链DNA的效果,筛选生成的5’单链突出端长度在15‑25个核苷酸范围内的DNA重组酶突变体为用于基因克隆的DNA重组酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:刘喜朋杜飞
申请(专利权)人:刘喜朋杜飞
类型:发明
国别省市:上海;31

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