本发明专利技术涉及一种环丙烷甲酸酯水解酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该重组酶用于拆分制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。与现有技术相比，本发明专利技术的环丙烷甲酸酯水解酶具有较好的热稳定性，使用该酶催化制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酸具有催化剂用量少、底物浓度高、对映选择性好、反应条件温和等优点，因此在肾脱氢二肽酶抑制剂西司他汀中间体的生产中具有很好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种环丙烷甲酸酯水解酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组表达转化体，该重组环丙烷甲酸酯水解酶的制备方法，以及该环丙烷甲酸酯水解酶用于拆分制备(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。
技术介绍
(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸[(S）-(+)-2，2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid，(S）-(+)-DmCpCa]，分子式：C6H10O2，分子量：114.14，沸点：100℃/12mmHg，CAS号为14590-53-5。（S）-(+)-DmCpCa是药物西司他汀的重要手性中间体。西司他汀(Cilsatatin)是一种由美国默克(Merck)公司开发的肾脱氢二肽酶抑制剂，其本身并无抗菌效果，仅仅是一种特异性的酶抑制剂，与药物亚胺培南组合使用；亚胺培南(Imipenem)是一种β-内酰胺类抗生素，具备高效的抗菌活性，但易于被肾脱氢二肽酶所破坏。临床试验证明，当亚胺培南单独给药时，经肾小球过滤、分泌作用后，位于近端的肾小管上皮细胞中的肾脱氢二肽酶会催化其水解而使其活力损失约60～95％，从而导致活性药物浓度的降低。当西司他汀与亚胺培南两者组合使用后，西司他汀可以抑制肾脱氢二肽酶的活力，进而有效地降低肾脱氢二肽酶对亚胺培南的水解作用，使得亚胺培南的AUC(24h内稳态血药浓度-时间曲线下的面积)增加20％，在尿液中回收的活性药物高达70％。因此市售的药物是由西司他汀与亚胺培南按1∶1的比例制成的复合制剂一泰能(Tienam)。泰能是第一个成功应用于临床的新型碳青霉烯类抗生素，特别适用于由多种病原体所致疾病以及需氧/厌氧菌共同引起的混合感染，这些病原体/细菌通常对氨基糖甙类、头孢菌素类以及青霉素类抗生素产生耐药性，而对碳青霉烯类抗生素比较敏感。目前泰能是用于重症感染的首选药物，同时也是全球畅销药物之一。 (S）-(+)-DmCpCa的生产方法包括两大类：化学不对称合成法和外消旋体拆分法，其中拆分法又包括化学法拆分与生物法拆分两种。与化学法相比，生物拆分法具有反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等优点，更适合于工业应用。 采用生物拆分法制备(S）-(+)-DmCpCa及其衍生物，一般采用的是水解酶。根据不同类型的水解酶催化底物的结构差异，用于拆分的底物可分为三类：2，2-二甲基环丙烷甲腈、2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和2，2-二甲基环丙烷甲酸酯。王梅祥等应用Rhodococcus sp.AJ270催化2，2-二甲基环丙烷甲腈非对映选择性水合生成酰胺，后者可被进一步对映选择性水解，生成(S)-(+)-DmCpCa。当底物2，2-二甲基环丙烷甲腈浓度为20mM时，30℃反应3h后获得(S）-(+)-DmCpCa的ee值为82％，产率为39％(J.Mol.Catal.B：Enzymatic2002，18：267-272)。瑞士Lonza公司以2，2-二甲基环丙烷甲腈为拆分底物，底物浓度为300mM，先由含有腈水合酶的整细胞催化2，2-二甲基环丙烷甲腈水合生成2，2-二甲基环丙烷甲酰胺(欧洲专利，公开号EP 0524604；美国专利，公开号US 5427934)，后者又进一步地被细胞内的酰胺酶选择性的水解，最终产物为(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和(R)-DmCpCa。该方法中产物(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺最终得率为35％，ee值大于98％。这两种方法均以腈为底物，反应的绿色安全性较低。郑裕国等从土壤中筛选得到两株产(R)-酰胺酶的微生物菌株，一株为Delftia tsuruhatensis CCTCC205114，细胞经固定化后，催化10mM的2，2-二甲基环丙烷甲酰胺水解，在pH8.5、35℃条件下反应40min，得到(R)-(-)-DmCpCa的产率为49.5％，ee值＞99％，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率＞49％，ee值为97.7％(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2010，37：503-510)；另一株为Brevibacterium epidermidis CCTCC207076，使用整细胞作催化剂，在底物浓度10mM，pH7.4、35℃下反应70min，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率为41.1％，ee值＞99％(J.Appl.Microbiol.2008，105：1150-1157)。如果以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物，操作步骤简单，而且成本较低。王普采用固定化脂肪酶Novozyme435对映选择性水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DmCpCe)制备(S）-(+)-DmCpCa，当酶量为16g/L时，转化65mM底物需要64h，产物得率为45.6％，ee值为99.2％。而后他们利用亲水性离子液体作为反应介质虽可将底物浓度提高至100mM，反应时间缩短12h，但由于商品化的Novozyme435价格偏高，并且酶的活力相对较低，重复使用后酶的活性及选择性也有所下降，因此难以满足工业要求(Chin.J.Catal.2010，31：651-655；中国专利技术专利，公开号CN102559833 B)。刘朝红以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物进行野生菌的筛选，发现Rhodococcus sp.ECU1013能够选择性地水解底物生成(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，两相反应中底物浓度为400mM，反应120h，最终产物的收率为38％，eep为99％(Appl Microbiol Biotechnol.2013，97：7659-7667；中国专利技术专利，授权公开号CN 102757924 B)。 与传统化学合成法相比，生物催化制备(S）-(+)-DmCpCa的方法具有环境友好、反应条件温和、操作简单等优点，但是目前以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，反应时间较长等缺陷，不适合工业化生产。因此，需要筛选活力高、稳定性好、选择性高且能在较短反应时间获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产西司他汀中间体(S）-(+)-DmCpCa的需求。
技术实现思路
本专利技术针对酶法拆分制备(S）-(+)-2，2-DmCpCa中现有技术上的不足，提供了一种催化活力高、对映选择性好、底物耐受性好的环丙烷甲酸酯水解酶及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体及重组表达转化体，该重组酶的制备方法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，其是如下的蛋白质(a)或蛋白质(b)：蛋白质(a)：由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；蛋白质(b)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有环丙烷甲酸酯水解活性的衍生蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，其是如下的蛋白质(a)或蛋白质
(b)：
蛋白质(a)：由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
蛋白质(b)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或
多个氨基酸而得到的具有环丙烷甲酸酯水解活性的衍生蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的蛋
白质(b)为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位丙氨酸残基、第148位缬
氨酸残基或第254位甘氨酸残基分别单点替换为其他氨基酸残基或对单点替换进
行组合后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的蛋
白质(b)为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位丙氨酸残基替换为缬氨酸残
基，同时第254位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求2所述的一种环丙烷甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的蛋
白质(b)为SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第147位丙氨酸残基替换为异亮氨酸
残基，同时第148...
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，张龑，栾政娇，潘江，郁惠蕾，张志钧，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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