降解纤维素的酶及其构建和应用制造技术

本发明专利技术涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。降解纤维素的酶为序列表SEQ ID NO：1或序列表SEQ ID NO：2中氨基酸所示。本发明专利技术可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。

【技术实现步骤摘要】
降解纤维素的酶及其构建和应用
本专利技术涉及纤维素酶，具体的说是一种降解纤维素的酶及其构建和应用。
技术介绍
纤维素酶在造纸、食品、饲料、纺织和能源等工业领域都有着广泛的应用价值。纤维素酶可以将纤维素降解为寡糖或单糖。纤维素酶可以分为内切纤维素酶、外切纤维素酶、和β-葡萄糖苷酶。内切纤维素酶又称内切-1,4-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）,专一性切断纤维素的葡聚糖链中β-1.4-糖苷连键，产生低聚合度的葡聚糖或纤维寡糖。地衣聚糖酶，又称1,3-1,4-β-葡聚糖酶（EC3.2.1.73），具有严格的底物专一性，它专一性切断1,3-1,4-β-葡聚糖中与3-O-吡喃葡萄糖基团相连接的β-1,4-糖苷键。1,3-1,4-β-葡聚糖是禾本科植物细胞壁的组成成分，尤其在谷类植物（如小麦、大麦、玉米、水稻等）胚乳细胞壁中大量存在。嗜热的地衣聚糖酶，在工业生产中拥有巨大优势，比如在酿造和动物饲料工业中。在啤酒发酵过程中，禾本科植物内源的地衣聚糖酶是热失活的；因此，添加外源地衣聚糖酶可以酶解混合连键的高分子量的β-葡聚糖，从而降低发酵液的黏度，提高过滤速度及提取产率，同时也会避免啤酒成熟过程中产生沉淀。在动物饲料工业，特别是肉鸡以及猪的饲料工业生产中，添加外源地衣聚糖酶可以促进动物消化，降低卫生清洁。木质纤维素主要由纤维素和半纤维素构成，是地球上最丰富的纤维素来源。在木质纤维素的生物转化及加工过程中，往往需要高温条件，耐高温纤维素酶可以直接用于高温条件下的生物质加工与转化。并且，由于这些耐高温的酶具有热稳定性好，半衰期长等优点，因此可以提高酶的使用效率，在生产上降低酶的用量，减少生产成本。所以，耐高温纤维素酶受到越来越广泛的重视。极端嗜热厌氧菌解糖热解纤维素菌属于木质纤维素降解菌，无纤维小体结构，具有游离作用的木质纤维素酶系，可作为耐热纤维素酶的产酶菌株。同时，产生耐高温纤维素酶的微生物在培养过程中具有不易受其他微生物污染、高温条件可以降低发酵液粘度而易于搅拌、底物和产物都有较高的可溶性并能降低冷却费用等优点。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种降解纤维素的酶及其构建和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种降解纤维素的酶，降解纤维素的酶为序列表SEQIDNO：1或序列表SEQIDNO：2中氨基酸所示。所述降解纤维素的酶为内切纤维素酶和地衣聚糖酶；其中，内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列为，序列表SEQIDNO：1或序列表SEQIDNO：2中所示。所述内切纤维素酶和地衣聚糖酶为与序列表SEQIDNO：1或序列表SEQIDNO：2中所示氨基酸具有80％以上同源性的片段。降解纤维素的酶的构建方法，将含有内切纤维素酶或地衣多糖酶基因的重组表达载体分别导入宿主细胞，表达得到序列表SEQIDNO：1或序列表SEQIDNO：2中所示的内切纤维素酶和地衣聚糖酶的氨基酸序列。所述作为重组表达载体的出发载体为pEASY-E1、pET-22b、pET28、pET32、pQE-30、pGEX-4T-2、pBR322或pUC18。降解纤维素的酶的应用，所述序列表SEQIDNO：1或序列表SEQIDNO：2中氨基酸所示酶可作为用于纤维素的生物转化。所述内切纤维素酶可作为外切酶。本专利技术所具有的优点：本专利技术可以快速表达得到来源于热解纤维素菌的纤维素的生物转化的酶，且具有高的热稳定性、高的比酶活以及长的半衰期。附图说明图1为本专利技术实施例提供的SDS-PAGE检测纯化蛋白的分子量大小电泳图谱。具体实施方式实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的获得及其原核表达载体的构建该基因的克隆过程及其原核表达载体的构建过程包括以下步骤：一、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的克隆经过全基因组测序，内切纤维素酶设计如下引物：C-F:ATGAAGAAAGAATGTCTTAGAGTTTTTGCC-R:TTACATCTTTCCTGTAAGTTCTAAAATTTTG根据地衣聚糖酶的基因，设计如下引物：E-F:TCCAGTAACAGAGCCAAAATTCCE-R:TGTTGCTACACACCTCCCTT以提取的解糖热解纤维素菌，如解糖热解纤维素菌DSM8903（德国微生物菌种保藏中心，GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,DSMZ），解糖热解纤维素菌CGMCC1.5183（中国普通微生物菌种保藏管理中心，ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollection，CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），总基因组DNA为模板，分别以C-F与C-R；E-F与E-R为引物对，通过PCR的方式扩增得到目的基因片段。扩增内切纤维素酶的PCR反应体系为50μl，包括：细菌基因组DNA：1μl；10×PCRBuffer:5μl；dNTPMixture（各2.5mM）：4μl；引物C-F（20μM），1μl；引物C-R（20μM），1μl；LATaqpolymerase（5U/μl）:0.5μl；加ddH2O至总体系为50μl。PCR扩增条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30sec，54°C退火45sec，72°C延伸150sec，循环30次，72°C延伸10min。扩增地衣聚糖酶的PCR反应体系为50μl，包括：细菌基因组DNA：1μl；10×PCRBuffer：5μl；dNTPMixture（各2.5mM）：4μl；引物E-F（20μM），1μl；引物E-R（20μM），1μl；LATaqpolymerase（5U/μl）:0.5μl；加ddH2O至总体系为50μl。PCR扩增条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火45sec，72°C延伸90sec，循环30次，72°C延伸10min。解糖热解纤维素菌来源的内切纤维素酶具有多个结构域，其催化结构域属于糖苷水解酶5家族，另外，还具有1个碳水化合物结合结构域和3个S-layerhomology结构域。解糖热解纤维素菌来源的地衣聚糖酶，属于糖苷水解酶5家族。二、内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因表达载体的构建将步骤一经PCR获得的基因片段分别连接到表达载体pEASY-E1中，将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的连接产物分别转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，经PCR和测序鉴定后将含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的阳性克隆质粒分别命名为pEASY-E1-JX030399和pEASY-E1-KC958563，可用其进行内切纤维素酶和地衣聚糖酶的表达。实施例2、内切纤维素酶和地衣聚糖酶的表达、纯化将实施例1获得的含有内切纤维素酶和地衣聚糖酶基因的原核表达载体pEASY-E1-JX030399和pEASY-E1-KC958563分别转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，挑选阳性单克隆在37°C下摇菌至OD600为0.5后，加入1mMIPTG诱导，10小时后离心收集菌体，含有目的蛋白的菌体按1g菌体加入4ml磷酸盐缓冲液(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解纤维素的酶，其特征在于：降解纤维素的酶为序列表SEQ ID NO：1或序列表SEQ ID NO：2中氨基酸所示。

【技术特征摘要】
1.一种降解纤维素的酶，其特征在于：降解纤维素的酶为序列表SEQIDNO：2中氨基酸所示。2.一种权利要求1所述的降解纤维素的酶的构建方法，其特征在于：将含有地衣多糖酶基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到序列表SEQIDNO：2中所示的地衣聚糖酶的氨基酸序列。3.按权利要求2所述的降解纤维素的...

【专利技术属性】
技术研发人员：英瑜，张英伟，李福利，孙长江，孟冬冬，杨雪岗，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，北京旭阳化工技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37