一种四倍体矮牵牛的诱变方法技术

本发明专利技术公开了一种四倍体矮牵牛的诱变方法，该方法为：在二倍体矮牵牛2片子叶完全展开时期，用二甲戊乐灵和秋水仙素的混合药液滴到附着在2子叶之间生长点上，进行变温处理。处理后的植株与对照比较，选择叶片增大，叶片增厚、茎增粗，株高增加，柱头、花药和萼片变大等多个农艺性状发生变化，和解剖学性状如叶背气孔和花粉粒明显变大的植株作为变异植株，最后进行细胞学的鉴定，采集变异植株的幼小花蕾，观察雌蕊柱头体细胞有丝分裂中期分裂相，选择染色体数目2n=28的植株确定为四倍体植株。本发明专利技术处理时间短、诱变效率高，鉴定方法对仪器要求低，操作简单易行，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，该方法为：在二倍体矮牵牛2片子叶完全展开时期，用二甲戊乐灵和秋水仙素的混合药液滴到附着在2子叶之间生长点上，进行变温处理。处理后的植株与对照比较，选择叶片增大，叶片增厚、茎增粗，株高增加，柱头、花药和萼片变大等多个农艺性状发生变化，和解剖学性状如叶背气孔和花粉粒明显变大的植株作为变异植株，最后进行细胞学的鉴定，采集变异植株的幼小花蕾，观察雌蕊柱头体细胞有丝分裂中期分裂相，选择染色体数目2n=28的植株确定为四倍体植株。本专利技术处理时间短、诱变效率高，鉴定方法对仪器要求低，操作简单易行，具有较好的应用前景。【专利说明】
本专利技术属于园艺植物育种领域，具体涉及到。
技术介绍
植物多倍体是指体细胞中含有三个或三个以上染色体组，因具有巨大性、抗逆性强、结实性低和营养成分高等特点而得到广泛应用，多倍体化不仅能使植株基因活性及酶的差异性增强，而且还增强了植株的生态适应性、对逆境的抗耐性以及提高了光合效率等，对植株的生长量和某些生物产量、营养成分含量和品质有促进作用。研究植物的多倍体具有重要意义，不仅为植物进化提供大量的证据，而且在生产实践上也具有广泛的应用价值，在现代育种中具有广阔前景。 许多植物都可以通过自然突变产生四倍体，但因其变异率很低，不能满足人们对四倍体品种的需求。所以各国的科学工作者都在不断的探索新的高效诱变四倍体的途径，目前人工诱变主要采取物理诱变法和化学诱变法二种方法。 人工物理诱变主要是使用X射线、Y射线、紫外线、P射线和中子及Cl重离子为诱变源。吴明珠等早在1983年通过6tlC射线为辐射源获得了甜瓜短蔓多倍体变异株。利用高空环境具有高真空、微重力、高能粒子辐射、超净、无昼夜变化等空间诱变技术，可从中筛选出具有优良特性的变异植株，通过太空搭载诱变已获得一些在生产上大面积的推广的蔬菜品种。空间诱变效果显著，变异类型广泛，可得到各种变异类型，但其诱变效果不稳定、重复性差，难以在育种实践中应用。 化学方法诱变是目前应用最广泛的方法，主要诱变剂有秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烧、完萎脑、苯及其衍生物、有机神制剂、有机萊制剂(富民隆)等。秋水仙素是最常用的化学诱变剂，它与正在有丝分裂的细胞接触后，着丝点连接的姊妹染色体还是能够正常分离，但秋水仙素可抑制微管的聚合过程不能形成纺锤丝，使染色体不能排在赤道板上也不能分向细胞的两极，使细胞不发生分裂不能形成两个子细胞，因而最后就形成了染色体加倍的细胞。通过此方法已成功获得了很多多倍体农作物品种如培养出多倍体苹果、柑橘、葡萄、金丝小枣、西瓜、白菜、黄瓜、番茄、不结球白菜、花椰菜、芹菜、萝卜、金鱼草、百合、香石竹、君子兰等。 矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)又名碧冬爺为爺科碧冬爺属植物,为一年生草本花卉。矮牵牛花朵硕大，色彩丰富，花型变化颇多，目前矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为“世界花坛花卉之王”。我国矮牵牛于20世纪初开始引种栽培，仅在大城市有零星栽培，直到80年代初，开始从美国、荷兰、日本等国引进新品种，作为花坛后起之秀市场对矮牵牛需求越来越大，目前国内广泛种植的优良矮牵牛品种如重瓣“双瀑布”系列、大花“梦幻”系列、多花单瓣“庆典”系列和吊蓝等系列都为二倍体品种，利用多倍体诱变技术获得观赏性更高、抗逆性和适应性强的多倍体品种具有十分良好的应用前景，但对矮牵牛目前尚无多倍体化学诱变的专利技术报道。 现有秋水仙素诱导多倍体方法往往存在着幼苗死亡率高，诱导成功率较低(通常都低于10% )，容易形成嵌合体植株。诱变植株倍性细胞学鉴定一般将根尖作为检测对象，检测材料少且根尖切去后对植株生长影响较大，如采用对细胞核内DNA含量进行测定的方法，需要采用流式细胞仪，仪器昂贵、操作程序复杂技术要求高。
技术实现思路
为了克服现有诱导与鉴定技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种四倍体矮牵牛的诱变和鉴定方法，采用该方法能提高多倍体的诱变率，倍性鉴定时采用幼小花蕾作为鉴定材料，材料充足对植株生长不会产生影响，对仪器要求不高、操作过程相对简单易行。 为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为:，该方法包括如下步骤: (I)将矮牵牛种子播种在穴盘中，当幼苗2片子叶完全展开时，将脱脂棉放在2片子叶中间，与生长点紧密接触。2片子叶时期是比较好的时期，早或者晚效果不好，早了多倍体诱导效率低，晚了嵌合体比较多。 (2)将穴盘放置于光照培养箱中，每天早8点和下午3点进行处理，用质量浓度为1%的二甲基亚砜(DMSO)配制的二甲戍乐灵(Pendimethalin)6_60mg/L和秋水仙素质量浓度为0.1% -1%混合药液滴到附着在2子叶之间的脱脂棉上，对子叶展开期的二倍体矮牵牛幼苗进行处理，每天处理2次持续处理3天，采取变温处理，每次处理前3小时光照培养箱温度设定为15°C，处理后温度升高设定为30°C。处理结束继续在光照培养箱中生长5天后，移入温室大棚中。 (3)当诱变植株生长发育进入成株后，与对照初步进行农艺性状如叶片长度与宽度、叶片厚度、茎粗、株高、萼片长度与宽度、柱头和花药大小的比较，接着进行包括叶背气孔和花粉细胞大小比较鉴定，选择多个农艺性状和解剖学性状明显增加的变异植株，并在此基础上进行细胞学鉴定。于晴天早晨8:00-10:00取长度4?7mm的幼蕾，先置于0.002mol.1^8-羟基喹啉水溶液中预处理3小时，蒸馏水冲洗3次后转入卡诺氏固定液固定24小时，蒸馏水冲洗3次在lmol.L-1HCl溶液60°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次用滤纸吸干水，放入45% (体积百分浓度)醋酸溶液配制的1% (质量百分浓度)洋红染色液染色10小时。用镊子将幼蕾移入干净的载玻片上，用刀片切取雌蕊柱头部位，滴1-2滴I %洋红染色液，盖上盖玻片，用滤纸吸去多余洋红染色液。盖玻片上覆盖4-5层滤纸，用铅笔一端垂直敲打10余下，使材料尽量分散压平，最后用大拇指垂直按压，制片在酒精灯烘烤1-2秒。先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野，然后在10X100倍油镜下进行染色体计数。 步骤⑵中，所述药液的配制方法为:先配制质量浓度为1%二甲基亚砜溶液，再根据计算结果往里面添加二甲戊乐灵和秋水仙素，其中二甲戊乐灵是质量浓度为33%的乳油，即1000毫升乳油中有330克二甲戊乐灵。 有益效果:与现有技术相比，本专利技术所的优点在于: 1、诱导剂的选择:本专利技术采用二甲戍乐灵(Pendimethalin)为诱导剂,二甲戍乐灵为二硝基甲苯类除草剂(DNH)，较低浓度下仍与微管蛋白具有高度亲和性能形成复合体，通过干扰纺锤丝形成从而抑制细胞分裂中期的有丝分裂，使染色体加倍，与秋水仙素一起使用可提高诱导率，还可降低秋水仙素使用浓度，减少对幼苗的毒害降低死亡率。使用二甲基亚砜可利于诱变剂渗透发挥诱导作用。 2、变温处理:处理前设定温度为15°C，可抑制和减缓幼苗生长点有丝分裂活动，处理后提高至30°C加速生长点有丝分裂活动，使更多生长点分生细胞处于有丝分裂期，促使诱变率提高。 3、本专利技术中的鉴定方法:多倍体与二倍体植株比较一般具有巨大性，当诱变植株生长发育进入成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四倍体矮牵牛的诱变方法其特征在于，该方法包括如下步骤： （1）将矮牵牛种子播种在穴盘中，当幼苗2片子叶完全展开时，用吸附液体效果较好的介质放在2片子叶中间，与生长点紧密接触；（2）将穴盘放置于光照培养箱中，每天早8点和下午3点进行变温处理，处理方法为：用质量浓度为1%的二甲基亚砜配制的二甲戊乐灵6‑60mg/L和质量浓度为0.1%‑1%的秋水仙素混合后得到的药液滴到附着在2片子叶之间的介质上，对子叶展开期的二倍体矮牵牛幼苗进行诱导处理，每天处理2次持续处理3天；（3）将处理结束的幼苗继续在光照培养箱中生长5天后，移入温室大棚中；（4）当诱变植株生长发育进入成株后，初步进行农艺性状、解剖学鉴定，在此基础上进行细胞学鉴定，选择染色体数目2n=28的植株确定为四倍体植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏跃，嵇怡，樊开青，刘艳，张莹，史红林，陈啸寅，颜志明，王全智，贾思振，董慧，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32