脑膜脓毒黄杆菌分子检测方法技术

本发明专利技术涉及病原生物学、分子生物学技术及生物信息学领域，涉及脑膜脓毒黄杆菌分子检测方法。本方法包括：分别针对脑膜脓毒黄杆菌16srRNA和脑膜脓毒黄杆菌特异性功能基因和核酸片断的DNA序列设计引物和探针，如编码脑膜脓毒黄杆菌糖苷酶、脑膜脓毒黄杆菌类糖苷酶、脑膜脓毒黄杆菌几丁质酶、脑膜脓毒黄杆菌脯氨酰内肽酶、脑膜脓毒黄杆菌16SrRNA等特异性核酸序列，采用常规PCR，实时荧光定量PCR或多重PCR方法检测脑膜脓毒黄杆菌。本方法操作过程简单，特异性好，灵敏度高，是对现有脑膜脓毒黄杆菌传统培养检测方法的补充，具有临床实用价值。本发明专利技术还涉及PCR和实时荧光定量PCR的检测试剂盒及应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及病原生物学、分子生物学技术及生物信息学领域，涉及。本方法包括：分别针对脑膜脓毒黄杆菌16srRNA和脑膜脓毒黄杆菌特异性功能基因和核酸片断的DNA序列设计引物和探针，如编码脑膜脓毒黄杆菌糖苷酶、脑膜脓毒黄杆菌类糖苷酶、脑膜脓毒黄杆菌几丁质酶、脑膜脓毒黄杆菌脯氨酰内肽酶、脑膜脓毒黄杆菌16SrRNA等特异性核酸序列，采用常规PCR，实时荧光定量PCR或多重PCR方法检测脑膜脓毒黄杆菌。本方法操作过程简单，特异性好，灵敏度高，是对现有脑膜脓毒黄杆菌传统培养检测方法的补充，具有临床实用价值。本专利技术还涉及PCR和实时荧光定量PCR的检测试剂盒及应用。【专利说明】
本专利技术涉及病原生物学、分子生物学技术及生物信息学领域，涉及病原体特异性分子，以及包括PCR技术，荧光定量PCR技术和多重PCR技术的分子检测技术，具体涉及。
技术介绍
脑膜胺毒黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum / Elizabethkingiameningosepticum)又名脑膜败血性黄杆菌，是一多耐药非发酵革兰氏阴性杆菌,可导致肺炎、新生儿脑膜炎、败血症等不同部位的感染。研究显示，易感人群多为机体免疫力低下、长期使用抗菌药物、接受放化疗干预及因基础疾病长期住院患者，患者两周内的死亡率在25%以上。临床分析显示，不合理使用抗生素和细菌生物膜的形成，与脑膜脓毒黄杆菌感染的死亡率显著相关。值得关注的是，该菌对包括第一至第四代β -内酰胺类抗生素，碳青霉烯类抗生素亚胺培南/西司他丁 (泰能)和美罗培南，单环内酰胺类氨曲南等广谱抗生素和氨基糖苷类抗生素庆大霉素的耐药率均在90%以上。近年来随着广谱抗菌药物在临床的广泛应用，脑膜脓毒黄杆菌多重耐药性不断增加，临床分离率已在非发酵革兰氏阴性杆菌中列第五位，给临床治疗带来困难，已成为严重威胁人类健康的条件致病菌。据临床研究数据统计显示，我国2010年感染脑膜脓毒黄杆菌的患者人数在2万5千人以上，其中80%以上为重症监护(I⑶)病人；死亡率高至25%。另一个值得关注的现象是，中国大陆和台湾地区脑膜脓毒黄杆菌感染的发病率较世界上其它国家的发病率高。 研究表明，脑膜炎脓毒性黄杆菌还可引起动物疾病的发生，尤其对水产养殖动物，从感染到发病，致死时间短，流行范围广，常在数日内大批死亡，对养殖业造成非常大的经济损失。报道从感染牛蛙、中华鳖的肝脏和腹水中分离到脑膜炎脓毒性黄杆菌，感染该细菌的牛蛙外观以体表褪色，全身性浮肿、瘫软，双眼白内障为特征，内脏以肾、膀胱病变为主的一种疾病，典型症状的牛蛙的肝、肾、眼、肌肉等组织取材，培养出该菌。据对肺、肝、心、肾、脾及肠等脏器病理切片革兰氏染色观察结果，以弥散型分布为主，也有呈细菌团的。又有报道在越南黄蟮鱼、美国青蛙中也分离到脑膜脓毒性黄杆菌。综上所述，脑膜脓毒性黄杆菌广泛存在，并引起人不同部位的感染，且可感染水生动物。脑膜脓毒黄杆菌的临床感染已成为一个需加强重视的难治性感染疾患。 目前该细菌的临床检测主要依靠常规的细菌学培养鉴定方法，一般需3— 7天，其存在操作繁琐，耗时费力，且检出率低的缺陷。 近年来，常规PCR检测技术、荧光定量PCR技术以及多重PCR技术的核酸检测技术对实现病原生物的快速检测发挥了至关重要的作用，但尚未用于脑膜脓毒黄杆菌的分子检测，其中， 常规PCR技术即聚合酶链反应(polymerase chain react1n, PCR),该技术可在短时间内将试管内特定的DNA片段扩增数百万倍，其基本原理类似于DNA的天然复制过程，利用与靶序列两端互补的寡核苷酸引物合成DNA。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使双链DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应预作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):单链DNA在温度降至55°C左右时，与引物互补序列配对结合；③引物的延伸:DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应底物，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。常规PCR在临床上已有应用，。 实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且具有灵敏度高、特异性好和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、具实时性和准确性等特点。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团，荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而增强，每经过一个PCR循环反应，定量PCR仪收集I次荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，从而得到I条荧光扩增曲线，荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在荧光定量PCR反应的指数期，需要设定I个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值，荧光阈值的缺省设置是I到15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，用它可以定义样本的循环阈值(Cycle Threshold, Ct)。Ct值是PCR扩增过程中，反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。这样，Ct值就可以预测起始的拷贝数。目前，该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域。 通常荧光探针有TaqMan类探针、分子信标类探针、荧光标记引物、杂交荧光探针和其它探针设计。TaqMan探针是一种寡聚核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而猝灭基团则在3’末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。一分子的产物生成就伴随一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。但是如果探针较长会使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底。此外，猝灭基团也可能产生不同波长的荧光。这些问题都会使得检测本底偏高。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针(minor groove binder oligodeoxynucleotide conjugate, MGB-0DN), 3’端米用了非突光性的粹灭基团一粹灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3’端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉_三妝(dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3),可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值一而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高:一个15bp的MGB探针的信噪比大于6，优于理想状态下的25bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
脑膜脓毒黄杆菌的分子检测方法，其特征在于，其包括：分别针对脑膜脓毒黄杆菌16srRNA和脑膜脓毒黄杆菌特异性功能基因和核酸片断的DNA序列设计引物和探针，采用常规PCR，实时荧光定量PCR或多重PCR方法检测脑膜脓毒黄杆菌；所述的脑膜脓毒黄杆菌特异性功能基因和核酸片断的DNA序列选自脑膜脓毒黄杆菌16srRNA、脑膜脓毒黄杆菌脯氨酰内肽酶（PEPase）、脑膜脓毒黄杆菌N‑糖苷酶（PNGase F）、脑膜脓毒黄杆菌类N‑糖苷酶（PNGL）、脑膜脓毒黄杆菌几丁质酶（CHTase）DNA序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈力，孙桂芹，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31