一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，提供了一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，包括：对α–变形细菌的标样，需要进行以下步骤：α–变形细菌标样的复苏；大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；α–变形细菌标样转化入感受态细菌；α–变形细菌标样的挑菌培养；α–变形细菌标样质粒的提取；α-变形细菌定量双链DNA含量的测定；待测生物膜样品的预处理；实时荧光定量PCR检测。本发明专利技术具有分析速度快、制约因素少、准确性高、减少主观因素影响的优点，为研究饮用水系统的微生物稳定性提供支撑，为给水管网的水质净化提供更加科学的依据。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种生物膜α‑变形细菌的定量检测方法，其特征在于，包括：步骤一，对α–变形细菌的标样进行预处理，得到新鲜活化的标样菌液，具体操作如下；将在低温下保存的α‑变形细菌标样取出，将其溶解至室温，并且充分混匀；进一步地，取混匀后的液态α‑变形细菌标样加入灭菌的LB液体培养基中；进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜活化的标样菌液；步骤二，大肠埃希氏菌感受态细胞的制备，具体操作如下：A.选用大肠埃希氏菌菌株，并且从LB固体平板上挑取单菌落置于灭菌的LB液体培养基中；进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜大肠杆菌菌液；B.将所述A中新鲜培养的大肠杆菌菌液充分混匀，取此大肠杆菌菌液放入灭菌的LB液体培养基中；进一步地，将其置于适当温度下进行培养；C.取所述B中培养后得到的大肠杆菌菌液；进一步地，将其放在离心机中预冷，使其降温；进一步地，将其放在离心机中进行高速离心，并缓慢去除上清液；D.向所述C中已经去除上清液的大肠杆菌菌液中加入预冷的灭菌CaCl2，充分混匀；混匀后，继续加入预冷的灭菌CaCl2；E.将装有所述D中菌液的离心管放在散冰中静置；进一步地，将静置后的离心管放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液；进一步地，向此离心管中继续加入预冷的灭菌CaCl2，在散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞；步骤三，将所述步骤一中经过预处理的α–变形细菌标样转化入所述步骤二中的大肠埃希氏菌感受态细菌菌液中，为考察感受态效果，选用阳性质粒进行转化试验，具体操作如下：A.分别从所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态细菌菌液中提取等量的液体放入2个离心管中；进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照；进一步地，向另一个离心管中加入阳性质粒，作为阳性对照；进一步地，将2个离心管都置于冰水混合物中，进行冰水浴；B.将A中冰水浴后的2个离心管分别放入水浴中进行热激；进一步地，迅速将热激后的2个离心管再次放置于冰水浴中冷却；C.向B中冰水浴后的2个离心管中分别加入灭菌的LB液体培养基，混匀后将2个离心管都置于恒温摇床中进行培养、复苏；进一步地，将复苏后的2个离心管都放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液；进一步地，将去除上清液的2个离心管充分混匀，混匀后将2个离心管内的菌液分别涂布到含氨苄青霉素的2块LB固体平板上；进一步地，分别倒置2块LB固体平板，并且将其都放在适当温度下进行培养；D.培养后，观察2块LB固体平板，若阴性平板无菌落，阳性平板菌落较多，则证明大肠埃希氏菌感受态菌液制作效果良好，将所述步骤一中制得的α‑变形细菌复苏活化后的新鲜菌液与所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液相连接，具体操作为：首先，分别从所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液中提取等量的液体放入多个离心管中；进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照，标记为空白样；进一步地，向其它离心管中分别加入α‑变形细菌复苏活化后的新鲜菌液，对应标记为α‑变形细菌；进一步地，将所有离心管都置于冰水混合物中进行冰水浴，并重复所述步骤三中的步骤B‑C；进一步地，培养后的多块LB固体平板为α‑变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细菌菌落产物；步骤四，对所述步骤三中制得的α‑变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细菌菌落产物的挑菌培养，具体操作如下：首先，在灭菌的LB液体培养基中加入氨苄青霉素；进一步地，向灭菌后的离心管中，加入从所述步骤三中制得的α‑变形细菌转化入大肠杆菌的LB固体平板中挑出的单个菌，再加入上述含有氨苄的LB液体培养基；进一步地，将上述离心管置于恒温摇床中进行培养；步骤五，采用质粒抽提试剂盒对所述步骤四中培养后的挑菌进行质粒提取，提取方法按试剂盒说明所述进行；步骤六，采用超微量核酸蛋白测定仪对所述步骤五中α‑变形细菌提取的质粒进行定量双链DNA含量的测定；步骤七，进行待测生物膜的预处理，具体操作为：首先，从水处理工艺或管道内壁采集生物膜样品；进一步地，向采集的生物膜样品中加入适量的灭菌生理盐水，并进行超声预处理；进一步地，采用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；进一步地，DNA提取完毕后，采用琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳对提取的DNA进行定量测量；步骤八，对所述步骤五、七中的标准α‑变形细菌、生物膜样品分别采用实时荧光定量PCR检测，具体操作为：A.标准α‑变形细菌的检测；根据所述步骤六中α‑变形细菌的DNA含量的测定结果，将所述步骤五中α‑变形细菌的质粒原液做5～10倍的连续梯度稀释，将稀释后的α‑变形细菌的质粒菌液作为标准品；进一步地，根据所述实时荧光定量PCR反应体系、条件绘制不同浓度的的α‑变形细菌标准品的标准曲线，来测定样品中目的基因模板量；B.对生物膜样品的检测；步骤九，对所述步骤八中测得的DNA含量进行结果分析；对步骤八中测得的...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴婕，王雪峰，张丽丽，李伟英，张东，王铮，
申请(专利权)人：上海浦东威立雅自来水有限公司，上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31