T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种T-DNA及其真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法。本发明专利技术T-DNA包括左臂、右臂DNA，以及二者之间的多克隆位点和eGFP基因，且该T-DNA具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列，本发明专利技术公开了其载体及构建方法；该T-DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增的上游引物对应于eGFP基因的左端序列，下游引物对应于右臂的左端序列；该右臂侧翼基因组序列的鉴定方法包括基因组DNA提取、酶切处理、纯化处理、连接反应、巢式PCR扩增及其产物鉴定、克隆和测序等步骤。本发明专利技术引物特异性强，能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T-DNA的右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高鉴定效率。

【技术实现步骤摘要】
T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法
本专利技术属于转基因
，具体涉及一种T-DNA及其插入位点右臂侧翼基因组序列的扩增引物和鉴定方法。
技术介绍
T-DNA（转移DNA）也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋形成的一种特殊结构。T-DNA是农杆菌Ti质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（如双子叶植物、真菌等）时分别诱发根瘤、opine化合物的合成和抑制细胞分化。Ti质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体；而外基因就是整合到T-DNA上的。农杆菌侵染受体后，Ti质粒中的T-DNA区段脱离质粒而整合到受体的染色体上。因此，如果把外源基因插入T-DNA中，就有可能携带进入受体并整合到染色体上。随着现代生物技术的发展，对农杆菌介导的真菌等转基因生物研究日益增多，T-DNA插入突变等反向遗传学技术已成为研究基因功能的一种重要途径，而T-DNA插入突变需要鉴定插入位点。目前，鉴定真菌T-DNA插入位点右臂侧翼基因组DNA序列常采用TAIL-PCR或Hi-TAIL-PCR扩增技术，也有采用质粒挽救、外加接头等PCR扩增的报道。但这些技术均或因模板处理或因引物不确定性问题而导致扩增效率低、重复性差，甚至呈偶然性事件而被采用；现有研究中也有个别采用巢式PCR扩增未知序列的报道，但因没有找到合适的限制性酶切位点或合适的引物对，导致其PCR扩增效率非常低，这种扩增也仅仅作为一种个例被采用。综上可知，当前亟需一种更高效、更准确、更具有普适性的T-DNA插入位点鉴定技术，以满足研究需求。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术设计了一种T-DNA，并利用T-DNA区自身含有的多克隆位点、限制性内切酶选择确定性和确定引物，再加上在多克隆位点区右边界添加的一个eGFP基因，通过巢式PCR扩增技术获得靶标基因组DNA序列，提供一种T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组DNA序列的鉴定方法，该方法能够快速、准确、高效、稳定、普适性地扩增出T-DNA的右臂侧翼基因组DNA序列，大大提高鉴定基因的效率。为实现上述目的，本专利技术设计了一种T-DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，以及二者之间依次的多克隆位点MCS和eGFP基因，该T-DNA具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。本专利技术还设计了一种载体，含有上述的T-DNA；该载体可通过以下步骤构建：(1)以真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T-DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列；(2)在T-DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因。对于上述的载体构建方法，所述步骤（1）采用如下具体方法:①pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300双元转化载体限制性内切酶HpaI酶切，去除T-DNA左臂区CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得T-DNA左臂区无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌潮霉素基因的pCB1004载体为模板，采用引物对HPH-F/HPH-RPCR扩增pCB1004载体的潮霉素基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HpaI酶切回收潮霉素克隆DNA片段；所述HPH-F引物序列为：HpaI5′-ACGTTAACGGATCCGTCGACGTTAACGTCGAG-3′；所述HPH-R引物序列为：HpaI5′-AGGTTAACGGGATCCGTCGACGTTAACTG-3′；③最后，将潮霉素克隆DNA片段与上述无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造。对于上述的载体构建方法，所述步骤（2）采用如下具体方法：①先将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP-F/eGFP-RPCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP-F引物序列为：HindIII5′-GAATTGGGTACTCAAATTGGTTC-3′；所述eGFP-R引物序列为：HindIII5′-ATCATCATGCAACATGCATGTAC-3′；③最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T-DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T-DNA区改造。本专利技术还设计了一种上述T-DNA真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增引物，其上游引物对应于上述eGFP基因的左端序列，其下游引物对应于上述右臂DNA的左端序列，具体引物序列如下：第一次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB1：5′-GGCACTGGCCGTCGTTTTACA-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGGGTTTCGGAATGT-3′；第二次扩增中引物对的核苷酸序列为：FxRB2：5′-ACGTCGTGACTGGGAAAACCC-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAATTTGAGTACCCAA-3′。本专利技术还设计了一种利用上述扩增引物对上述T-DNA的真菌插入位点右臂侧翼基因组序列的鉴定方法，包括如下步骤：（1）基因组DNA提取：取含有上述特异T-DNA插入的真菌体，采用CTAB法提取基因组DNA；（2）酶切处理：选择9种与T-DNA多克隆位点相对应的限制性内切酶EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SphI、SalI和PstI，任选一种单酶切基因组DNA，然后，再在75℃条件下水浴20min，使限制性内切酶完全失去活性后备用；（3）纯化处理：将所得酶切产物进行纯化；（4）连接反应：将所得纯化产物进行连接反应，连接反应结束后，加入体积百分比为75%的乙醇200μL，混匀5min，再以相对离心力12000×g离心10min后，去除上清液，去盐纯化DNA，干燥后加入20μL去离子水溶解DNA备用；（5）巢式PCR扩增及其产物鉴定：①第一次PCR扩增：将上步所得连接产物作为模板DNA，进行第一次扩增反应，采用25μL反应体系：5μL的5×PCRbuffer，1μL的1U/μLLongAmpTaqDNA聚合酶，0.75μL的10mmol/LdNTP，1μL的10μmol/LFxLB1，1μL的10μmol/LFxRB1，50～200ng的模板DNA，并加水补充至25μL；扩增反应运行程序：94℃预变性30s，94℃变性30s，55℃退火45s，65℃延伸6min，扩增30个上述循环反应后，再在65℃下延伸10min，第一次PCR扩增完成后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T‑DNA，包括左臂DNA、右臂DNA，其特征在于：在左、右臂DNA之间还依次包括多克隆位点MCS和eGFP基因，该T‑DNA具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以带有真菌trpC启动子的潮霉素基因DNA序列代替植物pCAMBIA1300双元转化载体中T-DNA左臂区中CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列；(2)在T-DNA多克隆位点右边添加一段eGFP基因，具体方法：①先将上步改造后的pCAMBIA1300双元转化载体采用限制性内切酶HindIII酶切，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得去磷酸化的具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌eGFP基因的pHBt2载体为模板，采用引物对eGFP-F/eGFP-RPCR扩增pHBt2载体的eGFP基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HindIII酶切回收含有HindIII粘性末端的eGFP基因克隆DAN片段；所述eGFP-F引物序列为：5′-ACAAGCTTGAATTGGGTACTCAAATTGGTTC-3′；所述eGFP-R引物序列为：5′-ACAAGCTTATCATCATGCAACATGCATGTAC-3′；③最后，将eGFP基因克隆DNA片段与上述具有HindIII粘性末端的双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现T-DNA多克隆位点右臂区一段eGFP基因添加，即完成T-DNA区改造，改造后T-DNA包括左臂DNA、右臂DNA，在左、右臂DNA之间还依次包括多克隆位点MCS和eGFP基因，从多克隆位点MCS到右臂DNA的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。2.根据权利要求1所述的载体构建方法，其特征在于：所述步骤（1）采用如下具体方法：①pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造，即pCAMBIA1300双元转化载体限制性内切酶HpaI酶切，去除T-DNA左臂区CaMV35S启动子和CaMV35S终止子之间的潮霉素基因DNA序列，并对酶切产物切胶回收、酶切产物磷酸化和磷酸化后产物纯化处理，获得T-DNA左臂区无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段；②再以含有真菌潮霉素基因的pCB1004载体为模板，采用引物对HPH-F/HPH-RPCR扩增pCB1004载体的潮霉素基因，并把PCR产物克隆到pMD19-T载体中，采用HpaI酶切回收潮霉素克隆DNA片段；所述HPH-F引物序列为：HpaI5′-GGATCCGTCGACGTTAACGTCGAG-3′；所述HPH-R引物序列为：HpaI5′-GGGATCCGTCGACGTTAACTG-3′；③最后，将潮霉素克隆DNA片段与上述无潮霉素基因的pCAMBIA1300双元转化载体线性DNA片段通过T4连接酶连接，实现pCAMBIA1300双元转化载体T-DNA左臂区潮霉素基因改造。3.一种扩增权利要求1所述改造后T-DNA的插入位点右臂侧翼基因组序列的巢式PCR扩增引物组，其特征在于：所述引物组由两条上游引物和两条下游引物组成，所述上游引物对应于权利要求1中所述eGFP基因的左端序列，所述下游引物对应于权利要求1中所述右臂DNA的左端序列，具体引物序列如下：第一次PCR扩增的引物对为：FxRB1：5′-GGCACTGGCCGTCGTTTTACA-3′，FxLB1：5′-GAAATTGGGGGTTTCGGAATGT-3′；第二次PCR扩增的引物对为：FxRB2：5′-ACGTCGTGACTGGGAAAACCC-3′，FxLB2：5′-GGGAACCAATTTGAGTACCCAA-3′。4.一种利用权利要求3所述扩增引物组鉴定权利要求1所述改造后T-DNA的插入位点右臂侧翼基因组序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）基因组DNA提取：取含有权利要求1所述改造后T-DNA插入的真菌体，采用CTAB法提取基因组DNA；（2）酶切处理：选择9种与T-DNA多克隆位点...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁慎，徐小利，赵卫星，常高正，李晓慧，程丹丹，
申请(专利权)人：河南省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41