本发明专利技术公开了一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法，属于发酵工程技术领域；该方法包括重组菌种子液培养；种子液接种入发酵培养基中；发酵期间补加补料培养基；发酵结束得到发酵液；发酵培养基和补料培养基中均含有诱导剂乳糖；发酵培养基的组成为(g/L)：胰蛋白胨15-20、酵母提取物10-20、氯化钠10-20、乳糖1-5和水；补料培养基的组成为(g/L)：胰蛋白胨50-100、酵母提取物25-50、甘油300-500、乳糖2-6和水。本发明专利技术简化了工艺，成本低，安全无毒，提高了菌体得率和蛋白表达量，有利于实现工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法
本专利技术属于微生物发酵工程
，具体涉及一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基以及发酵方法。
技术介绍
人粒细胞集落刺激因子(humangranulocytecolony-stimulatingfactors,hG-CSF)是一种特异的作用于粒系祖细胞，促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化并维持其功能、存活所必须的糖蛋白造血生长因子。1986年，由Nagata等从人鳞状细胞癌细胞系CHU-II中分离了hG-CSF基因，首次确定了其核苷酸序列并在COS细胞中表达(NagataSetal，Nature，1986，319：415-418)。人类有两种不同的G-CSFcDNA，分别编码含207和204个氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的信号肽，成熟蛋白分子为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插了3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。人G-CSF分子量为19.6kD，PI为6.1，O-糖基化，对酸碱(pH2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。hG-CSF有5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸残基在Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键；Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键的形成对于维持G-CSF生物学功能非常重要。G-CSF在临床应用上具有重要意义，骨髓移植时可促进中性白细胞的恢复；改善再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症；明显改善癌症化疗时引起的严重的中性粒细胞缺乏，加大肿瘤治疗的力度，增强治疗效果；广泛应用于其他伴有中性粒细胞减少的疾病及抗感染等的治疗。G-CSF天然产物来源非常有限，远远不能满足临床上的需要，而基因工程的重组G-CSF的生物学活性与天然的相似，且可大规模生产G-CSF。1985年，WelteK从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中成功纯化并精制出hG-CSF，之后WelteK与SouzaLM又进一步确定这种hG-CSF的N段氨基酸排列顺序，将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌成功制得hG-CSF，从而开发出重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF，商品名为Filgratin(惠尔血)。该药于1991年获美国FDA批准上市。1993年，瞿成奎等人在国内首先克隆了人G-CSFcDNA，并在大肠杆菌中获得表达。此后，许多研发人员也致力于这方面的研究，由于G-CSF在原核生物中具有表达量低、生物学活性不如天然产物的缺点，不断优化发酵工艺，提高产品质量，降低生产成本显得十分重要。目前对重组粒细胞集落刺激因子发酵生产工艺的研究主要集中在工程菌株、高密度发酵培养以及包涵体复性、纯化等方面。诱导表达是目前在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白最常用和有效的策略。诱导的方式主要有三种：IPTG(异丙基-β-D-巯基半乳糖苷)、热诱导和乳糖诱导。重组粒细胞集落刺激因子发酵工艺目前主要采用IPTG诱导或者热诱导(如，42℃)。IPTG是一种非常高效的乳糖启动子诱导剂，IPTG诱导条件简单，效果持久稳定，但IPTG具有潜在的毒性，各国药典均不提倡使用，而且价格昂贵，因而不适宜在发酵罐中进行基因工程产品的规模化生产。此外，热诱导容易导致包涵体复性困难，复性率降低。乳糖是一种二糖，没有毒性，天然具有诱导乳糖操纵子的作用，且价廉易得，因而可能成为替代IPTG的诱导剂，对于各种利用原核表达系统进行重组蛋白的大规模生产，具有十分重要的现实意义和应用价值。但由于乳糖在作诱导剂的同时，也可以被细胞作为碳源代谢利用，其浓度是动态变化的，而且转运及转化涉及多个酶的参与，诱导机制比IPTG更为复杂，诱导条件不易掌握，需要对菌体生长及诱导条件进行更为精细的研究及优化才能稳定高效诱导重组菌体发酵表达hG-CSF。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的高效表达培养基，它包含乳糖作为诱导剂和碳源，通过对培养基中碳源、氮源、诱导剂及其它营养成分种类及含量、各培养基的配比的研究突破，解决了现有技术中乳糖作为碳源和诱导剂的工艺复杂、重组蛋白表达量低的难题；本专利技术的另一个目的在于提供一种采用上述高效表达培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，所述发酵方法将诱导剂包含在培养基中，省去了IPTG诱导和热诱导常用步骤，精简了工艺，此外，乳糖无毒性，且价格低廉，适于重组医用蛋白的大规模工业生产，有极其重要的价值。本专利技术的技术方案为：一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水；所述补料培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的20％～30％。进一步地，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70～100g/L、酵母提取物40～50g/L，甘油360～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。优选地，所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，优选20～25g/L，酵母粉7～14g/L，优选10～14g/L，氯化钠6～15g/L，优选10～15g/L，余量为水，pH值调节为7.0～7.2；所述种子培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的1％～3％。本专利技术还提供了利用上述的培养基制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其具体步骤如下：①.将已转化利用pET-9a载体和人G-CSF基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养至OD600为0.8～1.2，得到发酵种子液，所述人G-CSF基因序列如SEQIDNo.1所示；②.将发酵种子液按发酵培养基体积的1％～3％的比例接种到灭菌的发酵培养基中，培养3～6小时；③.按发酵培养基体积的20％～30％的比例向发酵体系中补加灭菌的补料培养基继续发酵，18～22小时后结束发酵得到重组菌发酵液，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。进一步地，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70～100g/L、酵母提取物40～50g/L，甘油360～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水。优选地，所述已转化重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养得到发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基，包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基，其特征在于所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨15～20g/L，酵母提取物10～20g/L，氯化钠10～20g/L，乳糖1～5g/L，余量为水；所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨50～100g/L、酵母提取物25～50g/L，甘油300～500g/L，乳糖2～6g/L，余量为水；所述补料培养基按体积计算为所述发酵培养基体积的20％～30％。
【技术特征摘要】
1.一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的发酵方法，其具体步骤如下：
①.将已转化利用pET-9a载体和人G-CSF基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌接种于种子培养基培养至OD600为0.8～1.2，得到发酵种子液，所述人G-CSF基因序列如SEQIDNo.1所示；
②.将发酵种子液按发酵培养基体积的1％～3％的比例接种到灭菌的发酵培养基中，培养3～6小时；
③.按发酵培养基体积的20％～30％的比例向发酵体系中补加灭菌的补料培养基继续发酵，18～22小时后结束发酵得到重组菌发酵液，
其特征在于，所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠10g/L，乳糖1g/L，余量为水，所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨100g/L、酵母提取物50g/L，甘油360g/L，乳糖2g/L，余量为水；或所述发酵培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨18g/L，酵母提取物20g/L，氯化钠20g/L，乳糖5g/L，余量为水，所述补料培养基的成分及其含量为：胰蛋白胨70g/L、酵母提取物40g/L，甘油500g/L，乳糖6g/L，余量为水；
所述种子培养基的成分及其含量为胰蛋白胨15～25g/L，酵母粉7～14g/L，氯化钠6～15g/L，余量为水，pH值调...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，戴建国，文勇，徐传学，
申请(专利权)人：江苏奥赛康药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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