用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法及使用所述方法产生的植物技术

本发明专利技术涉及通过代谢工程使用由对芥子醇的优异的酶特异性导致具有优异的丁香苷合成能力的重组糖基转移酶UGT72E3/2基因、参与类苯基丙烷生物合成途径的F5H和CHS基因和作为参与木质素生物合成途径的基因的正转录调节因子的Myb58基因产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法。本发明专利技术还涉及通过该方法产生的植物。本发明专利技术的方法和植物使得具有广泛药学应用的丁香苷可以在植物中大量且有效地生成，由此使得关于作为食品或药品具有高价值的农用生物材料的工业得到发展。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基于对芥子醇的显著酶特异性的具有优异的丁香苷合成活性的重组糖基转移酶UGT72E3/2基因，基于用参与类苯基丙烷生物合成途径的F5H、HCT和CHS基因和作为用于正调节参与木质素生物合成途径的基因的转录因子的Myb58基因的代谢工程，用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，以及涉及通过该方法获得的植物。
技术介绍
从通过类苯基丙烷合成途径产生的作为构成木质素的组分的芥子醇(s型木质素单体(monolignol))中，通过糖基转移酶(UDP-葡萄糖转移酶)产生作为s型木质素单体糖苷的丁香苷。在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有约100种糖基转移酶，已报道，其通过形成包括植物激素和次级代谢产物的多种化合物的糖苷，调节细胞活性和这些化合物在液泡中的储存。它们之中，报道过UGT72E2和UGT72E3作为糖基转移酶负责首先将木质素单体如松柏醇和芥子醇特异性地转化为木质素单体糖苷。特别是，作为生成丁香苷所需的芥子醇特异性糖基转移酶，UGT72E3对芥子醇具有很好的底物特异性，但其糖基转移酶活性很低，使其应用受到很大限制。因此，在丁香苷(其是药学上功能性次级代谢产物)大量生产和应用前，发展有利于在植物中有效生成丁香苷的新的糖基转移酶仍然是首要解决的问题。此外，为了通过类苯基丙烷合成途径在植物中有效生成丁香苷,还需要具有使作为以微量存在于植物细胞中的丁香苷前体的芥子醇的含量增加的代谢工程技术，以及对芥子醇具有底物特异性的强糖基转移酶活性。特别是，将刺五加苷B(丁香苷)归类为来自植物的代表性适应原，其是来自刺五加(E.senticosus)的药用成分，针对应激具有良好的心理和身体的适应效果。适应原是表示增强活体响应各种应激的非特异性抗性而不引起副作用的植物次级代谢产物的术语。近期，据报道，分离出的纯态的丁香苷对成为现代城市中生活的人的严重问题的糖尿病和抑郁症表现出良好效果，并因此其应用较以往更加广泛。然而，由于刺五加的种植范围受到限制，且因此药用成分根据种植区域有巨大的变化，因此难以具有用于商业用途的丁香苷的生产所需的刺五加的稳定供应。从而需要基于使用生物工程技术调节植物代谢途径来发展用于稳定生产植物次级代谢产物如高价值产品丁香苷的技术。同时，韩国专利申请公开号2004-0004764公开了“包含具有肝脏保护活性的刺五加提取物或其丁醇可溶性部分和具有抗氧化和肝脏保护活性的丁香苷的丁醇馏分以及丁香脂素-双-O-β-D-吡喃葡糖苷衍生物”。此外，韩国专利申请公开号1998-0072707公开了“具有肝功能保护活性的丁香苷的药物组合物”。然而，之前从未记载本专利技术所公开的用于产生具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法以及由所述方法获得的植物。本专利技术的详细说明待解决的技术问题本专利技术是鉴于前述需求而设计，并用于产生具有提高的糖基转移活性同时保持高水平的底物特异性的新的重组糖基转移酶。通过UGT72E2和UGT72E3基因的结构域交换(domain swapping)产生重组基因UGT72E2/3和UGT72E3/2。用花浸渍法产生了超表达每个UGT72E家族的转基因拟南芥。此外，作为丁香苷合成效率的定量分析结果，证实了新产生的重组糖基转移酶UGT72E3/2表现出比野生型UGT72E2和UGT72E3显著提高的丁香苷合成。此外，为了通过调节植物代谢途径提高丁香苷的产生，产生了超表达F5H和HCT基因(其调节用于在类苯基丙烷合成途径中调节底物流的重要步骤)的每个拟南芥转基因植物、缺少CHS基因功能的转基因植物，以及超表达作为木质素合成途径的正调节转录因子的Myb58的转基因植物。作为在将前述的转基因植物与超表达重组糖基转移酶UGT72E3/2的转基因植物杂交后，丁香苷合成效率的定量分析结果，已发现，来自同时超表达UGT72E3/2、F5H和Myb58蛋白的新产生的转基因植物的丁香苷生成量相比仅超表达UGT72E3/2蛋白的情况提高了10倍或以上，因此完成了本专利技术。解决问题的技术手段为了解决上述问题，本专利技术提供了重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQ ID NO:2构成。本专利技术还提供了编码UGT72E3/2蛋白的基因。本专利技术还提供了包含编码UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体。本专利技术还提供了用重组载体转化的宿主细胞。本专利技术还提供了相比野生型提高植物中丁香苷合成的方法，包括用重组载体转化植物细胞，以超表达UGT72E3/2基因。本专利技术还提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中用包含编码重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体转化植物。本专利技术还提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中用包含编码重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体和包含编码F5H(阿魏酸5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体转化植物。本专利技术还提供了相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中用包含编码重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体、包含编码F5H(阿魏酸5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体，以及包含编码Myb58或Myb63蛋白的基因的重组载体转化植物。本专利技术还提供了相比野生型在植物中具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中用包含编码重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体和敲除编码CHS(查尔酮合酶)蛋白的基因的重组载体转化植物。本专利技术还提供了用于产生相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，其中用包含编码UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体转化植物。本专利技术还提供了用于产生相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，包括使超表达UGT72E3/2蛋白的转基因植物和超表达F5H蛋白的转基因植物杂交，并选择同时超表达UGT72E3/2和F5H蛋白的转基因植物。本专利技术还提供了用于产生相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，包括使同时超表达UGT72E3/2蛋白和F5H蛋白的转基因植物和超表达Myb58或Myb63蛋白的转基因植物杂交，并选择同时超表达UGT72E3/2蛋白、F5H蛋白和Myb58或Myb63蛋白的转基因植物。本专利技术还提供了用于产生相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，包括使超表达UGT72E3\本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.11 KR 10-2012-0112763;2012.11.06 KR 10-2011.重组糖基转移酶UGT72E3/2蛋白，其由氨基酸序列SEQ ID NO:2
组成。
2.基因，其编码权利要求1所述的UGT72E3/2蛋白。
3.重组载体，其包含权利要求2所述的编码UGT72E3/2蛋白的基
因。
4.用权利要求3所述的重组载体转化的宿主细胞。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为植
物细胞。
6.相比野生型提高植物中丁香苷合成的方法，包括用权利要求3所
述的重组载体转化细胞，以超表达UGT72E3/2基因。
7.相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中所述植物
是用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体转化的。
8.相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中所述植物
是用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体和包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:
4组成的F5H(阿魏酸5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体转化的。
9.相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中所述植物
是用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体、包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:
4组成的F5H(阿魏酸5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体，以及包含编码由
氨基酸序列SEQ ID NO:6组成的Myb58蛋白的基因的重组载体转化的。
10.相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中所述植
物是用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体、包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:
4组成的F5H(阿魏酸5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体，以及包含编码由

\t氨基酸序列SEQ ID NO:8组成的Myb63蛋白的基因的重组载体转化的。
11.相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物，其中所述植
物是用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体和包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:
10组成的CHS(查尔酮合酶)蛋白的基因的重组载体转化的。
12.产生相比野生型具有提高的丁香苷合成的转基因植物的方法，
包括：
(a)用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移酶
UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体转化植物，以及
(b)由步骤(a)的转基因植物细胞再生植株。
13.产生相比野生型具有提高的丁香苷生成的转基因植物的方法，
包括：
(a)通过用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:2组成的重组糖基转移
酶UGT72E3/2蛋白的基因的重组载体转化植物，产生超表达UGT72E3/2
蛋白的转基因植物；
(b)通过用包含编码由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的F5H(阿魏酸
5-羟化酶)蛋白的基因的重组载体转化植物，产生超表达F5H蛋白的转基
因植物；以及
(c)使步骤(a)的所述超表达UGT72E3/2蛋白的转基因植物和步骤(b)
的所述超表达F5H蛋白的转基因植物杂交，并选择同时超表达所述
UGT72E3/2蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：南在星，权泽敏，初旸，
申请(专利权)人：东亚大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR