本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与小细胞肺癌早期病理演变有密切相关miR-886-3P的方法，包括以下步骤：(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测miR-886-3P表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期RNA水平筛查，同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与小细胞肺癌病理演变RNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患者，每年的花费是1.4万亿人民币，扣除成本35％约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本专利技术的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。 2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性(多态性)；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学)等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。 本专利技术人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术)指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于 早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆)前，就可以做到早期预测和筛查。 微小核醣核酸(microRNA/miRNA)是一段长度约为22核苷酸的寡核醣核酸分子，它们可以藉由调控mRNA来抑制转译作用或是造成mRNA的□解□□低基因的表現。近來有許多研究发现，miRNA與癌症具有高度的相关性。因此推论miRNA可能是癌化過程的一個導因。到目前為止，在人体上有超過700個miRNA被發現，而大约有100左右的miRNA被確認與人類癌症具有相關性，這其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、脑癌、肝癌、直肠结肠癌、胶质细胞瘤、垂体瘤等多种肿瘤在食道癌细胞中，miR-17-92家族等microRNA在多种肿瘤中表达上调。种miR-21在成胶质细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等多恶性肿瘤中上调表达。 虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤发病及预后相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断。相比较而言，外周血血清较易获得和检测，临床应用便捷，利于推广。血清中是否存在血清microRNA的表达谱与对应肿瘤组织microRNA表达谱关联？2008年至今已报道多项 血清microRNA与肿瘤关系的研究工作，为血清microRNA作为分子标记应用于肿瘤的早期诊断和预后提供了工作基础。 但是，由于血清中microRNA的表达量较低，寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清microRNA应用于肿瘤临床检测亟待解决的问题。国际上多家研究机构报告了miR-886-3P与小细胞肺癌的生存密切相关，miR-886-3p低表达致小细胞肺癌患者生存期缩短，易发生癌细胞转移。 本专利技术选择多组临床标本(肺癌病人、高危人群、正常对照)采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法对miR-886-3P与小细胞肺癌的早期预警进行检测分析。 本专利技术人在研究中发现miR-886-3P在小细胞肺癌患者、癌症高危人群(20年以上烟龄)、正常对照人有明显的表达量变化，将miR-886-3P作为早期筛查小细胞肺癌变前期有非常重要的临床诊断意义。miR-886-3P在小细胞肺癌变前期过程中低表达。他作于肺癌癌变前期筛查、及小细胞肺癌治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。 专利技术人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，专利技术人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。 目前，miR-886-3P表达谱检测方法用Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(本专利技术人长期研究中用双标记技术发现，在细胞中RNA与蛋白翻译、转录、表达有时候不同步)。根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测 miR-886-3P水平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。 本专利技术人在针对创新性专利技术的要求，设计了(小细胞肺癌患者、高危人群、正常对照)不同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上小细胞肺癌症病人miR-886-3P低表达，高危人群有不同程度表达15-25％，正常对照都是高表达。表明miR-886-3P小细胞肺癌变前期筛查的重要标志物。 原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：NR_030583所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述
的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO：NR_030583所示的序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物
质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6.一种miR-886-3P基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以
下步骤：
(1)在权利要求1所述的杂交探针与靶序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，裘霖，张玉丽，
申请(专利权)人：嘉兴瑞康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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