利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法技术

本发明专利技术属于作物标记辅助育种技术领域，具体涉及利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法。本发明专利技术的特征包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤。利用化学诱变剂诱变甘蓝型油菜种子，在5-6叶期喷施除草剂苯磺隆，初步筛选得到抗除草剂的突变体材料，自交得到稳定遗传的抗除草剂油菜突变体株系，提取油菜突变体株系基因组DNA，扩增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段，其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该基因BnaAHAS3第536bp处存在一个C/T突变。本发明专利技术还公开了抗除草剂的特异性标记的制备，以及在无遮挡化学杀雄制种中的应用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用抗除草剂基因的油菜化学杀雄制种方法，包括化学杀雄步骤，其特征在于，它还包括培育耐受化学杀雄剂的父本材料和无遮挡的化学杀雄步骤，包括如下步骤：(1)利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理甘蓝型油菜华双5号种子，筛选得到M1代种子，种植M1代种子，于开花期分单株套袋自交，得到M2代种子；在第二个种植季节播种M2代种子，在M2植株4‑6叶期时喷施2.5mg/L的除草剂苯磺隆溶液，每隔7d按同样的浓度连续喷施两次，20d后挑选未受伤害的植株作为抗除草剂的甘蓝型油菜突变体的初筛材料，于成熟期套袋收取自交种子，得到M3代种子；在第三个种植季节播种该M3代种子，考察M3代的除草剂抗性的稳定性，验证获得抗除草剂的突变株系M45；(2)提取步骤(1)所述的抗除草剂的突变株系M45基因组DNA，以特异性引物分别扩增BnaAHAS1基因(基因登录号Z11524)和BnaAHAS3基因(基因登录号Z11526)，所述扩增BnaAHAS1基因的引物的DNA序列为：BnaAHAS1‑F：TCAAGAACAGTTAGATCCAC，BnaAHAS1‑R：GATCACCAGCTTCATCTCT；扩增BnaAHAS3基因的引物为：BnaAHAS3‑F：CTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT，BnaAHAS3‑R：ACTGAAACTAAGTCTTTTACCAT；得到如序列表SEQ ID NO：1所示的片段，在该片段的第536位存在一个C/T突变；`(3)根据BnaAHAS3基因片段的第536位的SNP侧翼序列，设计一对基于PCR和酶切的dCAPS标记，该标记是由两条引物序列组成，其DNA序列如下所示：正向引物BnaAHAS3_dCAPS‑F：5’‑CACAAACTCATTCATCATCTCTCTCTCATTTC‑3’，反向引物BnaAHAS3_dCAPS‑R：5’‑ACGATTGGCGTCTCTTGGAACGCGTCAGTACCGATCATCCGGCCA‑3’，通过PCR扩增得到如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；(4)通过杂交和分子标记辅助选择将SEQ ID NO：1所示的基因片段导入甘蓝型油菜品种或自交系中，得到抗除草剂的父本，该父本含有抗除草剂显性核基因Bnaahas3；(5)在田间无遮挡条件下，以甘蓝型油菜品种或自交系为母本，以携带有Bnaahas3抗除草剂基因片段的品种或自交系作父本，按父母本1:2或1:3的行比种植，在母本花蕾2‑3mm长时喷施0.05mg/L的除草剂苯磺隆溶液，间隔7d连续喷施三次，于成熟期收获母本上的杂交种子。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克德，吴江生，刘超，李海涛，李娟娟，赵波，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42