用于毛细管电泳的高速高分辨率组合物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供用于高速高分辨率地分离分析物的组合物、方法和试剂盒，所述分离通过毛细管电泳采用未涂敷的毛细管进行。所述组合物含有：包括非交联的丙烯酰胺聚合物的筛分组分和包括至少一种不带电荷和非交联水溶性二氧化硅吸收聚合物的表面相互作用组分。本发明专利技术还提供在毛细管电泳中采用新颖组合物的方法，以及提供包括用于新颖方法的新颖组合物的试剂盒。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用于毛细管电泳的高速高分辨率组合物、方法和试剂盒本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US01/42271，中国国家申请号为01816229.0，申请日为2001年9月25日，专利技术名称为“用于毛细管电泳的高速高分辨率组合物、方法和试剂盒”。
本专利技术涉及用于由毛细管电泳分离分析物的组合物、毛细管电泳元件和方法。也提供用于由毛细管电泳分离分析物的试剂盒。
技术介绍
由于如下几项技术优点，毛细管电泳已经广泛用作分析技术：(i)毛细管具有高表面积对体积比，它允许更有效的热耗散，该热耗散因此允许使用高电场用于更快速的分离；(ii)该技术要求最小的样品体积；(iii)可获得大多数分析物的优异分辨率；和(iv)该技术易于自动化，参见，如Camilleri，编辑，毛细管电泳：理论和实践(CRCPress，BocaRaton，1993)；和Grossman等人，编辑，毛细管电泳(AcademicPress，圣地亚哥，1992)。由于这些优点，因此，人们的极大兴趣在于应用毛细管电泳以分离生物分子，特别是核酸。核酸，特别是脱氧核糖核酸(DNA)的快速和精确分离的需要引起聚合酶链反应(PCR)产物的分析和DNA测序，参见，如Williams，方法：酶学方法中的陪伴，4：227-232(1992)；Drossman等人，Anal.Chem.，62：900-903(1990)；Huang等人，Anal.Chem.64：2149-2154(1992)；和Swerdlow等人，核酸研究，18：1415-1419(1990)。由于在游离溶液中，对于不同大小的多核苷酸，电荷对摩擦拖动比相同，因此多核苷酸的电泳分离典型地包括筛分介质。初始选择的筛分介质典型地是交联的凝胶，但在一些情况下稳定性和制造性的问题导致如下非凝胶液体聚合物筛分介质的检验：如线性聚丙烯酰胺、羟烷基纤维素、琼脂糖、和乙酸纤维素等，如Bode，Anal.Biochem.，83：204-210(1977)；Bode，Anal.Biochem.，83：364-371(1977)；Bode，Anal.Biochem.，92：99-110(1979)；Hjerten等人，J.LiquidChromatography，12：2471-2477(1989)；Grossman，U.S.专利5,126,021；Zhu等人，U.S.专利5,089,111；Tietz等人，电泳，13：614-616(1992)。可使由毛细管电泳的分离复杂化的另一种因素是电内渗现象。此现象，有时称为电渗透或电渗流(EOF)，是在毛细管中由电场诱导的流体流动。此现象阻碍毛细管电泳对如下状态的应用：其中典型地追求高分辨率分离，如在DNA测序片段的分析中。当毛细管内壁包含固定电荷时，该现象可引起毛细管电泳。这样的电荷可引起反荷离子移动层的形成，该移动层的形成依次，在电场存在下移动以产生液体的总体流动。令人遗憾的是，EOF的数量可依赖于多种因素的主体而变化，包括电荷分布的变化、分析物组分和/或分离介质的选择性吸附、分离介质的pH等。由于可变性可降低人们接近地解析间隔分析物谱带的能力，已经进行许多尝试以直接或间接控制这样的流动。这些尝试包括毛细管内壁的共价涂敷或改性以抑制带电基团，高粘度聚合物的使用，缓冲剂pH和/或浓度的调节，用于共价涂敷毛细管壁的凝胶分离介质的使用，和对向毛细管轴为径向的电场的施加。目前，通常使用预涂敷的毛细管进行核酸片段的毛细管电泳。预涂敷的毛细管一般制造昂贵，具有有限的寿命，并有可经受再生性的问题。对于采用大规模毛细管电泳使用并联运行的多个毛细管，这些问题是特别重要的。
技术实现思路
本专利技术提供用于分离样品中分析物的组合物。例如，DNA测序片段或其它多核苷酸片段的单碱基分辨。提供的所述组合物含有：包括至少一种低粘度、高分子量、非交联的丙烯酰胺聚合物的筛分组分；和非必要地，包括至少一种非交联的聚合物的表面相互作用组分。在优选的实施方案中，组合物并不包括交联的聚合物凝胶。另一方面，本专利技术包括毛细管电泳元件。毛细管电泳元件包括向其中插入用于分离分析物的组合物的未涂敷毛细管。位于毛细管中的组合物含有筛分组分和表面相互作用组分。在另一方面，提供一种方法，其中本专利技术的组合物用于由毛细管电泳分离分析物。在某些实施方案中，本专利技术的方法使用多个未涂敷的毛细管或包含在此公开的新颖组合物的毛细管电泳元件并联进行。在另一方面，本专利技术提供含有低粘度、高分子量、非交联的丙烯酰胺聚合物筛分组分而没有与其使用的相互作用组分的组合物，和此外的预涂敷毛细管。预涂敷的毛细管，例如购自BioRadLifeSciences(BiocapXL毛细管，目录no.148-3081)。毛细管也可以使用本领域公知的方法预涂敷。这样的程序，例如，描述于Cobb等人，Anal.Chem.62：2478(1990)，和Grossman，U.S.专利No.5,347,527。本专利技术也提供由毛细管电泳分离分析物的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括在此提供的一种组合物。也提供包括与一种或多种这些组合物或方法一起使用的未涂敷的毛细管的试剂盒。附图说明图1说明使用50。C的运行温度和含有平均分子量大约为744,000道尔顿(Da)(0.75M)；1,376,000Da(1.4M)；2,015,000Da(2.0M)；2,517,000Da(2.5M)；或6,377,000Da(6.4M)的非交联的丙烯酰胺聚合物筛分组分的组合物，由标记的多核苷酸分子量梯度物的毛细管电泳收集的单碱基分辨率数据。图1A(上部)显示单碱基分辨率对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图示1B显示以分钟计的片段迁移时间对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图2说明使用图1所述的相同五种组合物，但在60℃的运行温度下由标记的多核苷酸梯度物的毛细管电泳收集的单碱基分辨率数据。图2A(上部)显示单碱基分辨率对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图示2B显示以分钟计的片段迁移时间对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图3说明使用图1所述的相同五种组合物，但在70℃的运行温度下由标记的多核苷酸梯度物的毛细管电泳收集的单碱基分辨率数据。图3A(上部)显示单碱基分辨率对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图示3B显示以分钟计的片段迁移时间对在核苷酸碱基中测量的片段大小的图。图4说明使用含有在图1中所述五种筛分组分的组合物，在50℃，60℃或70℃的运行温度下观察到的单碱基分辨率极限。此单碱基分辨率极限由图1，2和3中所示的单碱基分辨率数据的目测观察而预测。具体实施方式定义“丙烯酰胺”和“丙烯酰胺单体”表示具有通式H2C＝CR-C(＝O)NR1R2的结构，其中R可以是-H或-CH3，R1和R2可以独立地是-H、-CH3、-(CH2)xOH、-CH2CH(OH)(CH2)yOR3、-CH(CH2OH)CH(OH)CH3、-CH2CH2(OCH2CH2)p-OR3、-CH2CONH2、R3可以独立地是-H、-CH3或-CH2CH3。x和y的数值为1-3和p的数值为1-200。“平均分子量”表示由具有分子量多重性的聚合物种组成的样品种群的重均分子量(Mw)。此数量由如下公式定义：其中ni表示物种i分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由毛细管电泳分离分析物的组合物，该组合物含有：包括分子量为1,000,000至3,000,000道尔顿的非交联的丙烯酰胺聚合物的筛分组分；和包括一种或多种选自N，N‑二取代聚丙烯酰胺和N‑取代聚丙烯酰胺的非交联的聚合物的表面相互作用组分，其中所述N‑取代基选自C1‑C3烷基、卤素取代的C1‑C3烷基、甲氧基取代的C1‑C3烷基、和羟基取代的C1‑C3烷基；其中筛分组分和表面相互作用组分相同或不同；其中所述组合物并不包括交联的聚合物凝胶。

【技术特征摘要】
2000.09.25 US 09/668,9601.一种毛细管电泳元件，该元件包括：未涂敷的毛细管；在未涂敷的毛细管中用于分离分析物的组合物，该组合物含有：包括分子量为1,000,000至3,000,000道尔顿和在25℃下的粘度为小于10，000厘泊的非交联的丙烯酰胺聚合物的筛分组分；和表面相互作用组分，该表面相互作用组分包括一种或多种非交联的聚合物的溶液；和其中毛细管电泳元件并不包括交联的聚合物凝胶。2.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物在25℃下的粘度为小于5000厘泊。3.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物在25℃下的粘度为小于1000厘泊。4.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物在25℃下的粘度为小于600厘泊。5.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中一种或多种表面相互作用组分非交联的聚合物选自N，N-二取代聚丙烯酰胺和N-取代聚丙烯酰胺，其中所述N-取代基选自C1-C3烷基、卤素取代的C1-C3烷基、甲氧基取代的C1-C3烷基和羟基取代的C1-C3烷基。6.根据权利要求5的毛细管电泳元件，其中所述表面相互作用组分非交联的聚合物是聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)。7.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物还含有至少一种变性剂。8.根据权利要求7的毛细管电泳元件，其中所述至少一种变性剂为选自甲酰胺、脲和2-吡咯烷酮的至少一种物质。9.根据权利要求8的毛细管电泳元件，其中所述至少一种变性剂包括脲。10.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述未涂敷的毛细管包括二氧化硅、煅烧的二氧化硅、石英、硅酸盐基玻璃、磷酸盐玻璃或含氧化铝的玻璃。11.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述未涂敷的毛细管包括塑料基材。12.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物含有：包括分子量为1,000,000至3,000,000道尔顿和在25℃下的粘度为小于600厘泊的线性丙烯酰胺聚合物的筛分组分；包括聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)的表面相互作用组分；和包括脲的变性剂；其中所述组合物并不包含交联的聚合物凝胶。13.根据权利要求12的毛细管电泳元件，其中所述未涂敷的毛细管包括二氧化硅、煅烧的二氧化硅、石英、硅酸盐基玻璃、磷酸盐玻璃或含氧化铝的玻璃。14.根据权利要求13的毛细管电泳元件，其中所述硅酸盐基玻璃是硼硅酸盐玻璃。15.根据权利要求12的毛细管电泳元件，其中所述未涂敷的毛细管包括塑料基材。16.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述组合物的筛分组分和表面相互作用组分不同。17.根据权利要求1的毛细管电泳元件，其中所述表面相互作用组分是疏水性的。18.一种用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡尔·O·文斯，奥尔德里奇·N·K·劳，
申请(专利权)人：应用生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US