一种当归细胞超低温保存及植株再生的方法技术

本发明专利技术提供一种当归细胞超低温保存方法，步骤如下：（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载20min。本发明专利技术还提供超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，是将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到培养基上光照培养；之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为：光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃。本发明专利技术的方法简单易行，保存成活率高达100%，恢复培养时可快速增殖，并分化出较多的当归幼苗。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种当归细胞超低温保存方法，步骤如下：（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载20min。本专利技术还提供超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，是将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到培养基上光照培养；之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为：光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20℃。本专利技术的方法简单易行，保存成活率高达100%，恢复培养时可快速增殖，并分化出较多的当归幼苗。【专利说明】
本专利技术涉及一种当归细胞的超低温保存方法及植株再生的方法。
技术介绍
当归为伞形科植物当归的干燥根，始载于神农本草经，至今已有2000多年的历史，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，素有“十方九归”之称，是常用中药之一。当归除做药用外，还可作为保健食品和化妆品，市场对当归的需求量日益增大。药用当归大都来自于栽培品，但是当归对栽培条件要求很苛刻，种植区域狭窄，全国有90%的当归产自甘肃，再加之当归种植中麻口病、早期抽薹、生荒地育苗等难题长期影响着当归的产量和品质，对生态环境的破坏也较严重。因此，加快当归种质资源保存与新品种选育势在必行。当归是三年生植物药材，第一年种子育苗，秋末采挖储藏，第二年将种苗移栽，长成成株，秋末采挖药材，需要留种的植株，待到第三年开花结籽，采收种子。繁育周期长导致当归大田育种进展缓慢，花朵的体积小，去雄十分困难，种子在常温下保存一年后即失去发芽率，这对当归育种和种质资源保存相当不利。因此，采用生物技术进行中药材种质保存、种苗繁殖与新品种选育和活性成分工业化生产，是一条有效可行的途径。 20世纪70年代新发展起来的超低温保存技术，为种质资源保存提供了一条新途经。它是在-80°C (干冰温度)到_196°C (液氮温度)甚至更低温度下保存生物材料。生物材料在超低温条件下，其活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止，处于“生机停顿”的状态，因此能够有效保持生物材料的遗传稳定性和形态发生潜能，是一种可长期保存植物种质的有效方法。与就地保存和迁地保存等传统方法比较，该法具有不受病虫侵害、保存时间长、占用空间小、节省人力物力等优点。目前，在美国国家遗传资源保存中心采用超低温保存技术已成功保存2201个苹果和57个酸樱桃种质材料，最新研究报道表明，保存10年的苹果休眠芽，恢复生长后仍具有90%以上的成活率。现已证明，植物离体材料经超低温保存后，仍能在适宜的条件下迅速大量繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。目前超低温保存的植物数量不断增加，但多集中于苹果、樱桃、柑橘、香蕉等木本植物以及一些薯类植物。虽然利用超低温保存技术成功保存了以上植物，但这并不意味着以上方法在任何植物物种或品种中都具有通用性。保存的植物不同、组织器官不同(悬浮细胞、愈伤组织、芽尖、茎尖、胚、花粉、种子)，其适宜的保存方法都会有所差异，因此，超低温保存时关键就是针对不同植物，选择适宜的组织器官，进而选择适宜的超低温保存程序。 目前现有技术中没有关于当归细胞超低温保存的方法，更没有超低温保存的当归细胞的植株再生方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种当归细胞的超低温保存方法，该方法对所保存的当归细胞伤害小，保存后的细胞存活率高达100%，约7天后就开始恢复生长，并可以分化出形态正常的当归幼苗，本专利技术还提供超低温保存后的当归细胞的植株再生方法。该专利技术为当归大规模悬浮培养时种子细胞系的保存提供了技术保证，同时也为当归种质资源的保存和种苗的工厂化繁育以及转基因育种提供了一条有效途径。 本专利技术提供一种当归细胞的超低温保存方法，步骤如下:(1)将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；(2)将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；(3)将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；(4)当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载，卸载一次，卸载20min，所述卸载液的配方为:每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖；(5)恢复培养:吸干卸载液，以0.9-1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基中恢复生长，培养温度23°C，光强20001x、光照时间12h/d。 作为优选，所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15-30d的细胞。 更优选地，所述生长旺盛的当归悬浮培养细胞为继代培养15d的细胞。 作为优选，所述装载处理为在25°C装载处理lOmin，装载液为按每升计含0.4mol蔗糖和Imol甘油的混合溶液。 作为优选，步骤(2)中所述玻璃化溶液的配方为按每升计含:甘油30g+乙二醇15g+ 二甲基亚砜15ml+鹿糖13.7g。 作为优选，步骤(2)中所述脱水处理为在0°C脱水处理5_40min。 更优选地，步骤(2)中所述脱水处理为在0°C脱水处理5min。 本专利技术还提供一种超低温保存后的当归细胞的植株再生方法，步骤如下:(1)将解冻并卸载后的悬浮细胞接种到固体培养基上光照培养；所述固体培养基的配方为 1/2MS+2.0mg/L IBA+3wt% 蔗糖 +0.7wt% 琼脂；(2)之后转至成苗培养基中继续培养，培养条件为:光照强度1500LX，光照时间14h/d，培养温度20°C。 作为优选，步骤(I)中所述的光照培养的条件为培养温度23°C，光强20001x、光照时间12h/d。 作为优选，步骤(2 )中所述成苗培养基的配方为:MS+0.5mg/L BA+0.lmg/LNAA+3wt% 鹿糖 +0.7wt% 琼脂。 传统的玻璃化超低温保存程序中常常采用高糖或低温预培养，但大量试验研究结果显示，此种方法对当归悬浮培养细胞的保存效果不佳，保存后的存活率不高。在玻璃化保护液处理之后，通常要更换新的保护液然后投氮，本研究表明，可省去此步骤，直接投氮。在卸载时传统的方法是采用MS+蔗糖1.2 mol/L溶液对保存后的材料进行卸载，共2次，每次10分钟，本研究表明，I次即可，共20分钟。此外，试验研究表明，以当归休眠芽作保存材料时，冻存后芽的成活率很低，而且即使成活休眠芽很难进一步生长和繁殖，达不到种质保存的目的。 本专利技术的方法保存程序简单易行，保存成活率高达100%，而且保存成活的细胞恢复培养时可快速增殖，并分化出较多的当归幼苗。 本专利技术通过对玻璃化超低温保存过程中处理方法、条件的特殊设计实现了当归悬浮培养细胞的超低温保存，又进一步由超低温保存的细胞再生当归幼苗。该专利技术为当归大规模悬浮培养时种子细胞系的长期保存提供了技术保证，同时也为当归种质资源的保存和种苗的工厂化繁育以及转基因育种提供了一条有效途径。 【专利附图】【附图说明】 附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中:图1为当归悬浮培养细胞玻璃化超低温保存技术流程；图2为实施例1中恢复生长40天当归细胞的增殖情况；图3为PVS2处理时间不同时，当归细胞超低温保存后恢复培养增殖情况；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种当归细胞超低温保存方法，其步骤如下：（1）将生长旺盛的当归悬浮培养细胞装载处理；（2）将装载处理后的当归悬浮培养细胞用玻璃化溶液脱水处理；（3）将脱水处理后的当归悬浮培养细胞迅速投入液氮中进行超低温保存；（4）当需要使用悬浮细胞时，从液氮中取出，解冻，用卸载液卸载，卸载一次，卸载20min，所述卸载液的配方为：每升1/2MS培养液附加1.2mol蔗糖；（5）恢复培养：吸干卸载液，以0.9‑1.1cm大小的细胞团块接种于恢复生长培养基中恢复生长，培养温度23℃，光强2000lx、光照时间12h/d。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：晋玲，张延红，李应东，姬菊梅，
申请(专利权)人：甘肃中医学院，
类型：发明
国别省市：甘肃;62