一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种重组犬白细胞介素-2的制备方法和应用。利用PCR方法从犬外周血淋巴细胞扩增出犬白细胞介素-2成熟蛋白基因，将该基因连接到酵母表达载体pPICZaA上，构建出重组犬白细胞介素-2成熟蛋白基因重组载体，并通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。犬白细胞介素-2在毕赤酵母中获得了高效表达，表达的重组蛋白具有很好的生物学活性。本发明专利技术生产成本低，生产效率高，生物活性好，适合企业化生产。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组犬白细胞介素‑2的制备方法，其特征是由以下步骤构成：（1）重组载体pPICZaA‑CaIL‑2的构建：根据genbank上公布的序列，设计一对引物，通过PCR方法扩增出犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因，将犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因的PCR产物酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的pPICZaA酵母载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经EcoR I和Xba I酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，408bp大小的犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组pPICZaA‑CaIL‑2酵母表达载体已经构建成功；（2）含有犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌：制备毕赤酵母菌株X33的感受态细胞，取80 μl与5‑10 μg SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，然后转移到冰预冷的0.2 cm的电转移杯中，把电转化杯在冰上放置5 min后再在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电击条件为电压1500 V，电容25 μF，电阻200 Ω，温度0℃，电击结束，立即加入1 ml冰预冷的1 mol/L山梨醇，轻轻混匀，把电转化杯放入28℃温育30 min左右，再取100 μl转化后的菌液涂在含有Zeocin抗生素的YPDS固体培养基平板上，置28℃恒温培养2‑4 d，能在YPDS上生长的菌落为阳性转化子；（3）含犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的鉴定：根据酵母表达载体pPICZa‑A上的一部分基因序列分别在目的基因插入的两端设计一对引物，将筛选得到的重组高拷贝菌株，提取酵母染色体DNA，用引物PCR扩增鉴定整合上CaIL‑2基因的酵母菌株；（4）含犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因的重组酵母菌株的诱导表达：挑取阳性克隆单菌落转接至BMGY中，28℃摇床培养至OD600=2‑6时，室温1,500 g离心5 min收获细胞，将收获的细胞用BMMY培养液重悬，28℃摇床振荡培养诱导表达，每24 h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.5%，以保持诱导的持续表达，在诱导72 h时收集培养上清备用；（5）含犬白细胞介素‑2成熟蛋白基因的重组酵母菌株表达产物的初步纯化：将诱导表达培养液离心，收集上清液留样后，用50 mM的Tris‑HCI缓冲液溶解，装入透析袋用50 mM的Tris‑HCI透析除去杂质，再用PH7.2的PBS于4℃搅拌透析36‑48 h，期间换液两次，然后用PEG20000浓缩蛋白，最后用滤膜过滤除菌，‑20℃保存备用。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱骞，宋珍华，秦海斌，李刚，温海，贺星亮，张汇东，
申请(专利权)人：公安部南京警犬研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32