本发明专利技术属于植物再生领域，提供一种快速繁殖美国红栌的培养方法，包括步骤：1)无菌体系的建立和增殖材料的准备，2)增殖培养：接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养，液体培养基的配方为MS+6-BA+NAA，3)生根培养：置换入液体生根培养基。生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5-1.0mg·L-1，培养基体积为100-150ml。本发明专利技术采用间歇浸没式培养，使培养物不是全程浸没在液体培养基中，避免了长期浸没在液体中对植物生长和形态发生的不良作用，提高了种苗的质量。间歇浸没式培养可以提供充足的营养和氧气供应，降低美国红栌苗产生的酚类物质等不利因素和不利气体的积累，使培养物快速生长。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于植物再生领域，提供，包括步骤：1)无菌体系的建立和增殖材料的准备，2)增殖培养：接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养，液体培养基的配方为MS+6-BA+NAA，3)生根培养：置换入液体生根培养基。生根培养基配方为1/2MS+IBA0.5-1.0mg·L-1，培养基体积为100-150ml。本专利技术采用间歇浸没式培养，使培养物不是全程浸没在液体培养基中，避免了长期浸没在液体中对植物生长和形态发生的不良作用，提高了种苗的质量。间歇浸没式培养可以提供充足的营养和氧气供应，降低美国红栌苗产生的酚类物质等不利因素和不利气体的积累，使培养物快速生长。【专利说明】一种快速繁殖美国红?卢的培养方法
本专利技术属于植物再生领域，具体涉及一种通过组织培养技术进行木本植物再生的 方法。
技术介绍
美国红护（Cotinus coggygria 'Royal Purple'）是一种木本观赏植物，漆树科 (Anacardiaceae)黄护属（Cotinus)，落叶灌木或小乔木，其树形美观大方，叶片紫红色并 保持一年三季常红，且季季有变化：初春时，树体全部叶片为鲜嫩的酒红色；春夏之交，叶 色红而亮丽；至盛夏时节，树体下部叶片开始渐渐转为绿色，而顶梢新生叶始终为紫红色； 入秋后整体叶色又逐渐转变为深酒红色，秋霜过后，叶色更加红艳。每年的夏季美国红栌在 枝条顶端开花，花序絮状鲜红，如烟雾笼罩，所以又有"烟树"之称。与普通黄栌（Cotinus Coggygria Scop.)相比，美国红护叶片较大，挂树时间较长，观景时间更长。 美国红栌有较强的耐寒和抗旱性，对培养基质和pH要求不严，在沙土、壤土，pH酸 性、盐碱性和中性土壤上均能生长。其根系发达，萌蘖性强，且对病虫害和污染能力有较强 的抗性。由于它具有独特的生物学特性，优于彩叶树种紫叶李、紫叶小檗和红花檣木等，是 一个极具观赏价值的树种。近几年，随着造林，森林旅游和园林绿化的发展，对美国红栌苗 木的需求量越来越大。 美国红栌种子萌发困难，且彩叶性状易分化变异，不能确保能保留其优异的观赏 性；扦插较难生根，嫁接的成活率较低等，诸方面因素限制了该种苗的生产和供应。通过 植物组织培养技术繁殖美国红栌，既能加快这一优良树种的繁殖速度，又能保持其优良性 状。美国红栌的体外繁殖目前仅采用传统固体组织培养技术，已有的技术有，申请号为 03106827. 8的"红栌高频率试管植株再生与工厂化育苗方法"和申请号为200410053515. 4 的"红栌的组培快繁方法"。但传统固体培养法费时费工，生产成本高，不能适应工厂化生 产的需求。在植物离体培养过程中，外植体褐化是影响扩繁结果的重要因素。褐化现象主 要是由于PP〇(P〇lyphenol oxidase，多酚氧化酶）作用于天然底物酚类物质，其被氧化产 生醌类物质，这类物质聚合后呈棕褐或黑褐色，积累在培养物底部或扩散到培养基中，毒害 培养的外植体材料，导致材料褐化，生长停顿，直至死亡（姚洪军等，1999)。许多木本植物 组织中含有较多的酚类化合物，褐化现象较为严重。通常漆树科黄栌属植物含酚类物质多。 本研究中的试验材料C. coggygria也是如此，在培养物的切口处通常产生大量酚类物质， 其氧化后形成褐色醌类物质并逐渐扩散到培养基中或包裹在愈伤或分化了的组织的表面。 这些褐色物质一般会抑制酶的活性，影响细胞代谢而阻碍新生组织的生长和分化。采用固 体培养，C. coggygria的离体培养物分泌的褐色物质易在切口处积累，并包裹在愈伤或分化 了的组织的表面，延迟了不定芽的生成，特别是阻碍了基部切口处根的发生，延长了扩繁周 期。 利用自动化、机械化方法进行植物体外再生来提高效率和降低生产成本已成为当 前的研究热点。采用液体培养易于实现自动化控制，但培养物长期浸润在液体中易出现超 度含水（hyperhydricity，又被称为玻璃化）现象，使用受限。间歇浸没式液体培养不仅能 为培养的植物器官或幼小植物提供一个良好的生长环境，还能减少培养时的人力投入，提 高种苗生产过程中的自动化程度。已有的技术有申请号为201110111047. 1的"半夏属植物 的组培快繁方法"、申请号为200910114406. 1的"利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组 织培养快繁"及我们专利技术团队申请号为201310175520. 1的"一种草莓微扩繁的液体培养方 法"。上述专利所公开的
技术实现思路
并未涉及美国红栌的间歇浸没式微扩繁技术。利用间歇 浸没式组织培养技术建立高效的美国红栌体外再生体系，为实现该树种种苗工厂化生产奠 定基础，有利于该树种在中国园林及生态环境建设中的应用。
技术实现思路
针对本领域存在的不足之处，本专利技术提出了一种美国红栌微扩繁的液体培养方 法。 为实现本专利技术目的的技术方案为： -种快速繁殖美国红栌的培养方法，包括步骤： 1)无菌体系的建立和增殖材料的准备 采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，清洗后切割成2. 0-3. 0cm长，带1-2个 节的茎段；灭菌处理后接种在添加了 2. 0g· Γ1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基 (Murashige and Skoog，1962)上；经过10d左右的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎 段转接入MS+6-BA0. lmg · P+NAAO. 4mg · Γ1培养基中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长 至1. 5-2. 2cm，将其剪下接入增殖培养基MS+6-BA0. 8mg · P+NAAO. 4mg · Γ1中诱导产生不 定芽，以备后续间歇浸没式培养使用； 2)增殖培养 以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料（长度彡2.0cm，保留2-3片叶 片），接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养。使用的液体培养基的配方为： MS+6-BA(0. 6-0. 8)mg .I^+NAAO)· 2-0. 4)mg 增殖培养阶段的浸没频率为 8-12 次/24h、 浸没时间为5-10min/次； 3)生根培养 增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基。使用的生根培 养基配方为：1/2MS+IBA(0. 5-1. 0)mg ·ΙΛ生根阶段浸没频率为6-10次/24h、5-10min/次； 步骤1)中的清洗是用洗涤剂水刷洗外植体表面附着的污物，在自来水下冲洗 30-60min〇 其中，所述步骤1)中的灭菌处理，用70-80%酒精浸泡20-408，再用0.1%!^(：1 2 灭菌5_8min，无菌水漂洗3-5次。 优选地，所述步骤1)中的MS基本培养基、MS+6-BA0. lmg · P+NAAO. 4mg · Γ1培养 基、增殖培养基MS+6-BA0. 8mg · P+NAAO. 4mg · L-1中均加有1中培养基均含有30g · L-1蔗 糖和5. 5g · Γ1琼脂。pH 优选地，所述步骤2)中，按照培养容器的容积每1.2L，接种不定芽10-15株。注入 液体培养基体积为100_150ml。 优选地，所述步骤2)中，增殖培养周期为28-30d。 优选地，所述步骤3)中，按照培养容器的容本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速繁殖美国红栌的培养方法，其特征在于，包括步骤：1)无菌体系的建立和增殖材料的准备采集美国红栌当年生带节的幼嫩茎段，清洗后切割成2.0‑3.0cm长，带1‑2个节的茎段；灭菌处理后接种在添加了2.0g·L‑1聚乙烯吡咯烷酮PVP的MS基本培养基上；经过10d左右的培养观察，把无菌且生长状态良好的茎段转接入MS+6‑BA0.1mg·L‑1+NAA0.4mg·L‑1培养基中，进行腋芽的诱导，待腋芽萌发生长至1.5‑2.2cm，将其剪下接入增殖培养基MS+6‑BA0.8mg·L‑1+NAA0.4mg·L‑1中诱导产生不定芽，以备后续间歇浸没式培养使用；2)增殖培养以步骤1)中得到的美国红栌不定芽为材料，接入植物微扩繁器中的培养容器内进行培养；使用的液体培养基的配方为：MS+6‑BA(0.6‑0.8)mg·L‑1+NAA(0.2‑0.4)mg·L‑1，增殖培养阶段的浸没频率为8‑12次/24h、浸没时间为5‑10min/次；3)生根培养增殖培养结束后，将液体增殖培养基排出，置换入液体生根培养基；使用的生根培养基配方为：1/2MS+IBA(0.5‑1.0)mg·L‑1，生根阶段浸没频率为6‑10次/24h、5‑10min/次。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑彩霞，石琨，于镇榕，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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