一种磷酸化肽的吸附富集方法、添加剂及其应用技术

本申请公开了一种磷酸化肽的吸附富集方法。本申请的吸附富集方法包括：(1)将非特异吸附抑制剂和部分待检样品添加到上样缓冲液，采用富集过滤柱进行磷酸化吸附富集；(2)收集富集产物，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作第一丰度，计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度，作第二丰度，第一丰度比第二丰度，选比值较高的至少一种氨基酸为添加剂；(3)采用加入添加剂的上样缓冲液，对待检样品进行磷酸化肽吸附富集。本申请，运用氨基酸与多肽的竞争吸附作用，减小非磷酸化肽的吸附，增加磷酸化多肽富集的吸附选择性，为提高磷酸化检测的准确性和稳定性奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸化肽的吸附富集方法、添加剂及其应用
本申请涉及蛋白质和多肽富集纯化领域，特别是涉及磷酸化肽的吸附富集方法，用于磷酸化富集的添加剂，该添加剂的制备方法和应用。
技术介绍
在生物体细胞中，蛋白质是主要的功能行使者，出于功能的需要，许多蛋白质在翻译中或翻译后会在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译后修饰。蛋白质的磷酸化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，可逆磷酸化控制着诸如细胞增殖、细胞分裂、细胞间信息传递和基因表达等细胞活动。但是，在蛋白质样品中，磷酸化蛋白质和磷酸化肽的含量非常低，存在各种非磷酸化肽和无机盐的干扰，使得磷酸化蛋白质和磷酸化肽的检测十分困难，因此，需要对样品进行磷酸化富集。二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法，在富集过程中对一些非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用。这些没有磷酸化的肽段与磷酸化肽段一同被富集，降低了磷酸肽富集的选择性。为了提高磷酸化肽富集选择性，需要在上样缓冲液中加入非特异抑制剂，以抑制非磷酸化的肽段被富集。目前，有多种非特异抑制剂被应用，如2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、邻苯二甲酸(PA)、谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸。但是，现有的非特异抑制剂在磷酸化肽富集中的效果并不好，特别是在目前比较常用的二氧化钛富集方法中，现有的非特异抑制剂的富集选择性一般在60％-70％左右；也就是说，仍然有30％-40％或更多的非磷酸化肽段被富集，这严重影响了磷酸化肽检测的准确性和稳定性。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新思路的磷酸化肽的富集方法，以及能够增强磷酸化的特异性吸附的添加剂，和该添加剂的制备方法和应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请公开了一种磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入了添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个富集过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。其中，肽段是由蛋白质酶解得到的，所以本申请中“非磷酸肽所在蛋白质”是指经过消化能得到此肽段的蛋白。需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的吸附富集方法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象或过滤柱进行调整，在本申请中不做具体限定。优选的，富集过滤柱为固相金属氧化物过滤柱；本申请中，金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱和二氧化硅过滤柱中的至少一种；优选为二氧化钛过滤柱。优选的，非特异吸附抑制剂选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。可以理解，在较次的方案中还可以采用其它具有类似功能的化合物或组合物作为非特异吸附抑制剂，在本申请中不做具体限定。本申请的另一面公开了一种磷酸化肽的金属氧化物富集法，包括：(1)将非特异吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，采用另外一个金属氧化物过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的金属氧化物富集法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象或过滤柱进行调整，在本申请中不做具体限定。优选的，金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱和二氧化硅过滤柱中的至少一种；优选为二氧化钛过滤柱。本申请的再一面公开了一种磷酸化肽的二氧化钛富集法，包括：(1)将非特异吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用二氧化钛过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个二氧化钛过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的二氧化钛富集法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用二氧化钛过滤柱对磷酸化肽进行富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象进行调整，在本申请中不做具体限定。本申请的再一面公开了一种用于金属氧化物富集法的添加剂的制备方法，包括以下步骤，(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度；(3)计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂。优选的，本申请的添加剂的制备方法中，金属氧化物富集法为二氧化钛富集法，金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。在本申请添加剂的制备方法的基础上，本申请还公开了一种由本申请的制备方法制备的添加剂。在本申请的添加剂的基础上，本申请还公开了一种添加有本申请的添加剂的上样缓冲液。本申请中，待检样品是指从动物、植物或其它生物样本中提取的蛋白质样品，通常呈冻干的固体或高浓度的液体。通常，进行磷酸化检测时，首先将该蛋白质样品溶于上样缓冲液中，然后采用金属氧化物富集法富集磷酸化肽，最后对富集处理后的样品进行磷酸化检测。需要说明的是，本申请中所有的非特异吸附抑制剂都可以采用常规的磷酸化吸附中所使用的非特异吸附抑制剂，本申请不做具体限定；但是，考虑到抑制效果，本申请优选的方案中，非特异吸附抑制剂都选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的磷酸化肽的吸附富集方法，灵活运用氨基酸与多肽的竞争吸附作用，在对磷酸化肽进行富集时，将非特异吸附的多肽中丰度较高的氨基酸作为添加剂加入到上样缓冲液中，由于竞争吸附，相对于肽段，分子量较小的氨基酸比较容易被吸附，从而减小了非磷酸化的肽段的吸附，增加了磷酸化肽富集方法的吸附选择性，为提高磷酸化检测的准确性和稳定性奠定了基础。附图说明图1：是本申本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入了添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个富集过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。

【技术特征摘要】
1.一种磷酸化肽的吸附富集方法，包括：(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入了添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个富集过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。2.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述富集过滤柱为固相金属氧化物过滤柱；所述金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱中的至少一种。3.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。4.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述非特异吸附抑制剂选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。5.一种磷酸化肽的金属氧化物富集法，包括：(1)将非特异性吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾金，张朝良，林梁，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44