本发明专利技术涉及一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗玉米赤霉烯酮的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的玉米赤霉烯酮抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的玉米赤霉烯酮的纯化，以便于后期对样本中玉米赤霉烯酮的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。该免疫亲和纯化柱利用蛋白G偶联到琼脂糖凝胶载体上，然后用抗玉米赤霉烯酮的抗体与琼脂糖上的蛋白G偶联。偶联后的玉米赤霉烯酮抗体-蛋白G-琼脂糖凝胶载体复合载体装填亲和柱。该免疫亲和柱主要用于对于食品、饲料、牛奶、血样以及其他多种样本中的玉米赤霉烯酮的纯化，以便于后期对样本中玉米赤霉烯酮的高效液相色谱(HPLC)检测和荧光检测。【专利说明】
： 本专利技术涉及一种玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检 测领域。
技术介绍
： 玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种2,4_二轻基苯甲酸内 酯类化合物，具雌激素活性，化学名称为6- (10-羟基-6-氧基碳烯基）-β雷锁酸-μ -内 酯。是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的真菌毒素。它广泛存在于自然界，对动物的生 长发育有着重要的作用，具有很强的雌性激素作用，可引起猪、大鼠、小鼠、家禽等多种动物 和人的雌激素过多综合征，还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。主 要污染玉米、小麦、大麦等粮谷类作物，。Plcinta对世界上近二十个国家的谷物和动物饲料 中的真菌毒素含量做了一个调查，发现大多数国家的谷物和动物饲料中都不同程度地受到 ZEN的污染并导致家禽的毒害，我国的江苏、四川、河北、上海郊区等地也发生过因 ZEN导致 猪中毒的事件。为了控制ZEN对人和动物产生的危害，至2003年，世界上已有19个国家制 订了食品中ZEN限量标准，而且欧盟于2005年制定了食品中ZEN统一限量标准。例如澳大 利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g，意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含 量不能超过l〇〇ng/g，而在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200ng/g。目前，中 国尚未建立食品中ZEN的国家标准检测方法，为保护中国在世界粮食贸易中的经济利益和 消费者健康，迫切需要建立测定ZEN的国家标准检测方法，并制订其限量标准。 目前玉米赤霉烯酮的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法（HPLC)、酶联免疫 吸附法（ELISA)、酶联免疫分析法等。 其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测玉米赤霉烯酮的方法，其优点 是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，。但是薄层层析 法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目 测半定量，主观影响较大，灵敏度不高等，已远远不能满足现代检测要求。 酶联免疫吸附试验（EL ISA)检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。 成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用，因此越 来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于 基层的筛查检测。 高效液相色谱法（HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常 用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期 长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和 柱-高效液相色谱（IAC-HPLC))将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使 用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广 泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，其中 的抗原与抗体结合，其他杂质则通过水溶液洗掉，再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来，从 而使样品中的毒素得以净化。4叩61〇等 用乙腈2水（90 : 10)提取玉米样品，用VicamZEN免疫亲和柱进行纯化，并用反相HPLC检 测。在0. 1?10 μ g/g的加标水平的回收率为93%?99. 5%，相对标准偏差为6%，检出限 为3ng/g,信噪比3 : 1。 目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、 过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体 上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制 的。势必影响亲和纯化柱纯化玉米赤霉烯酮的效率。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于提供 为了达到上述目的，在本专利技术中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌 细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。 我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出 了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将玉米赤 霉烯酮抗体偶联到蛋白G上，制备出了玉米赤霉烯酮-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进 行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。该亲和柱操 作简便，纯化玉米赤霉烯酮效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高 的玉米赤霉烯酮。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。 具体操作如下： 本专利技术最大的优势就是利用了蛋白G与Ig抗体特异性结合的特点，IgG抗体由两 条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域。 蛋白G是链球菌细胞壁上的一种特殊的蛋白，与抗体的Fc区域有特异性的结合能 力。蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。经过我 们基因优化重组后的蛋白G，1个分子的蛋白G可以结合3个分子的IgG抗体，具有很高的 抗体亲和力。并且只有抗体能与蛋白G结合，其余蛋白均不能与蛋白G结合，特异性很高。 以此蛋白G为基础制备的免疫亲和柱具有特异性好，玉米赤霉烯酮结合量大，纯化效率高 的特点。 玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法说明如下： 1.载体活化 选择琼脂糖载体，s印harose4B，以环氧氯丙烷活化法进行活化。 取2%的预溶胀的琼脂糖凝胶sepharose4B，用20倍体积的蒸馈水充分冲洗，洗去 残存的乙醇，用漏斗过滤掉水分。 称取滤去水份后的湿凝胶5克，加入7. 5毫升0. 8M的NaOH，30 %的环氧氯丙烷2 毫升，2mg/ml的硼氢化钠 NaBH4, 5毫升，在25°C下摇床反应8小时。 反应后，用大量的蒸馏水洗涤，去除凝胶中混杂的环氧氯丙烷。 2.将蛋白G与活化载体sepharose4B的偶联 将活化好的琼脂糖凝胶s印harose4B用偶联缓冲液（0. 1M的NaHC03,0. 8MNaCl， PH8. 9)洗涤3次。加入2mg/ml的蛋白G，室温偶联4小时。 将偶联好的琼脂糖载体用20mM，PH7. 4的磷酸缓冲液PBS洗涤3次。偶联有蛋白 G的琼脂糖载体sepharose命名为蛋白G-sepharose。 3.抗玉米赤霉烯酮抗体与蛋白G-sepharose载体上的蛋白G连接 蛋白G与抗体具有特异性的亲和力，在一定的反应条件下，将偶联有蛋白G的琼脂 糖凝胶与抗体进行连接。将抗体连接于琼脂糖上。由于蛋白G与抗体的结合部位是抗体的 Fc区域，抗体的抗原结合区不受影响，充分保证了抗体的抗原结合能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱，其特征在于包含有载体、蛋白G和玉米赤霉烯酮抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张彦明，
申请(专利权)人：北京华安麦科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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