本发明专利技术涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C，编码这个酶的基因及其应用。所述磷脂酶C的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQ ID No.2所示序列具有90％以上同源性。本发明专利技术所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化水解磷脂制备相应游离脂肪酸的酶对应编码基因的表达，赋予宿主漆酶的高表达性，为扩大磷脂酶C的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【技术实现步骤摘要】
冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C、编号基因及其应用(一)
本专利技术涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。(二)
技术介绍
冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(HepialusarmoricanusOberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。但是，对冬虫夏草中国被毛孢中磷脂酶C的研究几乎为空白，尤其在参与中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C的研究上。磷脂酶是在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶,其中主要包括磷脂酶A1、AC、B、C和D，它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物，被广泛用于甘油磷脂的改造。磷脂酶C(EC:3.1.4.3)可以催化PIP2分解产生1,4,5-肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)两个第二信号分子，是存在于胞浆膜上的一个关键酶。2001年，查纻光等人从广西产金环蛇(Bungarusfasciatus)毒腺中抽提总RNA，经mRNA纯化后构建了金环蛇毒腺cDNA文库。根据已发表的眼蛇科蛇毒磷脂酶A[2]基因序列中的保守区设计探针筛选克隆，得到2个磷脂酶A[2]基因。测定两者序列，其cDNA的阅读框均为435bp，编码145个氨基酸的磷脂酶A[2]前体。2002年，李伟琳用探针从紫红链霉菌2917基因组文库中克隆出磷脂酶A3基因，经双向测序，确定了其基因的全序列，并由此推导出其氮基酸序列，将此序列与其他来源的磷脂酶A2基因序列进行了比较研究，结果显示，与天蓝色链霉菌A3(2)中磷脂酶A2的同源性为98％，与蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10％。2007年，卢冬梅等人从超嗜热需氧古细菌AeropyrumpernixK1中抽提出染色体基因组，经PCR扩增得到磷脂酶A2基因，用带有His-tag标记的pET15b作为表达载体，在大肠杆菌BLP中成功地诱导表达。表达产物经过Ni.螯合柱一步得到纯化。SDS-PAGE检测只有一条带，其准确分子量为17.871kD。2007年，罗滟苏等人应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳(Toreniafournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到2个798和813bp的TfPLC1基因上游序列，经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。2010年，徐贤广等人研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用，本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，SDS-PAGE分析表明，重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20％，该蛋白经电洗脱纯化后，纯度达95％以上。2011年，JSSeo等人从牙鲆的cDNA上通过cDNA末端(RACE)快速扩增克隆到了一个磷脂酶C基因。该cDNA编码含有一个高度保守的PH结构域，催化X和Y结构域，C2结构域1244个氨基酸长度的多肽。2011年，SimonaAntonacci等人利用设计简并引物和RT-PCR的方法扩增出了一个270bp的DNA片段，并且利用RACE的方法分离到了一个全长为2290bp的磷脂酶C基因，含有1765bp的开放读码框。但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中磷脂酶C的基因相关信息。(三)
技术实现思路
本专利技术目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的一种磷脂酶C、以及编码的基因及其应用。本专利技术采用的技术方案是：一种参与中国被毛孢水解磷脂制备相应游离脂肪酸中的磷脂酶C(PhospholipaseC)，与SEQIDNo.1所示序列具有90％以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。优选的，所述磷脂酶C氨基酸序列如SEQIDNo.1所示(记为phoC蛋白)；该酶可催化磷脂制备相应的磷酸胆碱和甘油二酯。本专利技术述磷脂酶C来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。由磷脂经过磷脂酶C的催化获得对应磷酸胆碱和甘油二酯的路径如下所示：本专利技术还涉及所述的磷脂酶C在生物催化磷脂制备相应的磷酸胆碱和甘油二酯中的应用，具体的，所述应用为：将含磷脂酶C基因的重组工程菌经诱导培养后的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声细胞破碎后，将破碎混合液离心，取上清液为催化剂，以磷脂溶液为底物，于pH值为7.0的缓冲液(磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液)中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含磷酸胆碱和甘油二酯的混合液，将混合液分离纯化即获得磷酸胆碱和甘油二酯(所述分离纯化的方法为本领域公知操作，通常采用亲和层析技术进行)；所述磷脂溶液按如下步骤制备：将大豆磷脂用丙酮洗涤进行脱油处理，真空脱溶后，获得无油大豆磷脂；将无油大豆磷脂、质量浓度0.5％聚乙烯醇(PVA)溶于pH值7.0的缓冲液中，在10000r/min的条件下均质3min，得到磷脂溶液；所述0.5％PVA的体积用量以无油大豆磷脂质量计为3.33mL/g，所述磷脂溶液中无油大豆磷脂的终浓度为50g/L。所述磷脂溶液的用量以无油大豆磷脂质量计，所述无油大豆磷脂的初始浓度为48g/L(终浓度)，所述催化剂的用量以超声破碎前湿菌体的质量计为0.9g/L(终浓度)。所述催化剂按如下方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C，其特征在于所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种冬虫夏草中国被毛孢磷脂酶C，其特征在于所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的磷脂酶C在生物催化磷脂生成磷酸胆碱和甘油二酯中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含磷脂酶C基因的重组工程菌经诱导培养后的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，将破碎混合液离心，取上清液为催化剂，以磷脂溶液为底物，于pH值为7.0的缓冲液中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含磷酸胆碱和甘油二酯的混合液；所述磷脂溶液按如下步骤制备：将大豆磷脂用丙酮洗涤，真空脱溶后，获得无油大豆磷脂；将无油大豆磷脂、质量浓度0.5％聚乙烯醇水溶液溶于pH值7.0的缓冲液中，在10000r/min的条件下均质3min，得到磷脂溶液；所述0.5％聚乙烯醇水溶液的体积用量以无油大豆磷脂质量计为3.33mL/g，所述磷脂溶液中无油大豆磷脂的终浓度为50g/L。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述磷脂溶液的用量以无油大豆磷脂质量计，所述无油大豆磷脂的初始浓度为48g/L，所述催化剂的用量以超声破碎前湿...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，林善，薛亚平，吴晖，李邦良，许静，许峰，袁水金，王鸿艳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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